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heihei2866

铁虫 (正式写手)

[求助] 酶切片段都切碎了,什么原因 已有1人参与

本人最近在做PCR产物双酶切,本来PCR产物大小在1300 bp,测序验证正确,然后用salI和sphI双酶切后片段只有100bp了,条带非常亮,怀疑是酶切问题,分别用两个酶单酶切,时间也相应缩短,但是结果仍一样;换用了EcoRI和HindIII分别进行单酶切,结果仍一样,这是什么原因啊?之前实在没有碰到过,请各位高手指点一下!
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
什么情况?你克隆到载体上切下来的吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-06-19 11:04:36
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
heihei2866: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-06-23 12:29:33
你确定基因内部没有所用的酶的酶切位点吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-06-19 11:05:16
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heihei2866

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-19 11:04:36
什么情况?你克隆到载体上切下来的吗?

不是,我是用高保真的酶扩增的,PCR产物纯化后直接做酶切
4楼2014-06-19 11:23:44
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heihei2866

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-19 11:05:16
你确定基因内部没有所用的酶的酶切位点吗?

没有,这个序列测序了,确定没有这些酶切位点
5楼2014-06-19 11:24:23
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by heihei2866 at 2014-06-19 11:24:23
没有,这个序列测序了,确定没有这些酶切位点...

你不会说的是基因组测序分析的结果吧?那个不一定准的。PCR产物酶切结果发个图过来

[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2014-06-19 12:01:19
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heihei2866

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-19 12:01:19
你不会说的是基因组测序分析的结果吧?那个不一定准的。PCR产物酶切结果发个图过来
...

不是基因组测序结果,是PCR产物纯化后测序的结果,证明没有酶切位点,唉,酶切前后的电泳图如附图所示,我感觉是PCR产物被切碎了,只是找不到原因
酶切片段都切碎了,什么原因
酶切.png

7楼2014-06-19 16:27:18
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


heihei2866(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-20 10:43:48
引用回帖:
7楼: Originally posted by heihei2866 at 2014-06-19 16:27:18
不是基因组测序结果,是PCR产物纯化后测序的结果,证明没有酶切位点,唉,酶切前后的电泳图如附图所示,我感觉是PCR产物被切碎了,只是找不到原因

酶切.png
...

你这样太折腾啦,直接克隆到t载体,测序对了,将片段从t载体上切下来,稳妥点,你测了序列,又要这个基因,策略选的不好哦。

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-06-19 16:31:27
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heihei2866

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-19 16:31:27
你这样太折腾啦,直接克隆到t载体,测序对了,将片段从t载体上切下来,稳妥点,你测了序列,又要这个基因,策略选的不好哦。
...

呵呵,因为当时没有T-blunt载体,所以想直接酶切PCR产物做连接,我们之前这样做都没有问题的,就是现在出现这种奇怪的现象
9楼2014-06-19 16:39:54
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


heihei2866(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-20 10:44:00
引用回帖:
9楼: Originally posted by heihei2866 at 2014-06-19 16:39:54
呵呵,因为当时没有T-blunt载体,所以想直接酶切PCR产物做连接,我们之前这样做都没有问题的,就是现在出现这种奇怪的现象...

可以用taq加a或者直接用taq扩,平末端的载体有点小贵,平末端克隆没ta好做哦

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10楼2014-06-19 16:45:54
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