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tayifeita

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[求助] 蓝白斑筛选都是假阳性

我用phusion高保真酶扩一个2kb的目的片段，切胶回收后用30微升产物和30微升 taq mix以1比1的比例混合，72摄氏度加A尾20分钟。然后用pcr回收试剂盒回收。接下来用这次回收的目的片段4.5微升，PMD18-T 0.5微升和solution 1 .总共体系10微升酶连过夜。第二天来就做转化。涂在蓝白斑平板上后挑40个白斑进行菌落pcr。用m13引物。都没检测出条带。希望虫友们能帮忙分析下原因

[ Last edited by tayifeita on 2013-9-18 at 16:21 ]

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1楼 2013-09-18 15:22:25

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湘水悠悠

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我最近也是在做一个类似的，也是m13引物，但是是负引物

我最喜欢你，因为你让我活的最像自己

2楼2013-09-18 16:29:37

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tayifeita

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 湘水悠悠 at 2013-09-18 16:29:37
我最近也是在做一个类似的，也是m13引物，但是是负引物

负引物是什么意思？这个应该没有关系的吧

3楼2013-09-18 16:38:40

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假阳性会不会是酶切的原因。

辩证。

4楼2013-09-18 17:31:28

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18-T的蓝白斑不明显，可以多加一点x-gal,最好换成19-T比较好

我的生活我做主

5楼2013-09-20 22:54:13

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tayifeita: 金币+2, ★有帮助 2013-09-22 13:35:12

蓝白斑筛选本来就避免不了假阳性，可以在4度里面放几个小时，假阳性的白斑就会变成蓝斑。还有没P出来是不是条件有问题，可以双酶切试试

6楼2013-09-21 15:49:16

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cj1104

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亲蛋，高保真酶一般是不可以直接连接的哈，查无几乎应该都是平滑末端的，不可以连T载体

7楼2013-10-10 22:39:07

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tayifeita

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7楼: Originally posted by cj1104 at 2013-10-10 22:39:07
亲蛋，高保真酶一般是不可以直接连接的哈，查无几乎应该都是平滑末端的，不可以连T载体

你们加A是怎么弄得

8楼2013-10-14 18:43:35

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