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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蓝白斑筛选都是 假阳性
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tayifeita

木虫 (小有名气)

[求助] 蓝白斑筛选都是 假阳性

我用phusion高保真酶扩一个2kb的目的片段，切胶回收后用30微升产物和30微升 taq mix以1比1的比例混合，72摄氏度加A尾20分钟。然后用pcr回收试剂盒回收。接下来用这次回收的目的片段4.5微升，PMD18-T 0.5微升和solution 1 .总共体系10微升酶连过夜。第二天来就做转化。涂在蓝白斑平板上后挑40个白斑进行菌落pcr。用m13引物。都没检测出条带。希望虫友们能帮忙分析下原因

[ Last edited by tayifeita on 2013-9-18 at 16:21 ]
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1楼 2013-09-18 15:22:25
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湘水悠悠

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-18 18:24:59
我最近也是在做一个类似的，也是m13引物，但是是负引物
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我最喜欢你，因为你让我活的最像自己
2楼2013-09-18 16:29:37
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tayifeita

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 湘水悠悠 at 2013-09-18 16:29:37
我最近也是在做一个类似的，也是m13引物，但是是负引物

负引物是什么意思？这个应该没有关系的吧
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3楼2013-09-18 16:38:40
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因为吃饭

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-18 18:25:43
假阳性会不会是酶切的原因。
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辩证。
4楼2013-09-18 17:31:28
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yyw09030126

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tayifeita: 金币+2, 谢谢 2013-09-21 14:20:07
tayifeita: 金币+1, ★有帮助 2013-09-22 13:35:18
18-T的蓝白斑不明显，可以多加一点x-gal,最好换成19-T比较好
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我的生活我做主
5楼2013-09-20 22:54:13
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
tayifeita: 金币+2, ★有帮助 2013-09-22 13:35:12
蓝白斑筛选本来就避免不了假阳性，可以在4度里面放几个小时，假阳性的白斑就会变成蓝斑。还有没P出来是不是条件有问题，可以双酶切试试
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6楼2013-09-21 15:49:16
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cj1104

新虫 (初入文坛)
亲蛋，高保真酶一般是不可以直接连接的哈，查无几乎应该都是平滑末端的，不可以连T载体
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7楼2013-10-10 22:39:07
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tayifeita

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cj1104 at 2013-10-10 22:39:07
亲蛋，高保真酶一般是不可以直接连接的哈，查无几乎应该都是平滑末端的，不可以连T载体

你们加A是怎么弄得
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8楼2013-10-14 18:43:35
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