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1989zb

金虫 (小有名气)

[求助] pcr目的条带暗，怎么办呢？？

最近一直pcr,可是目的条带总是很暗，该怎么优化条件呢？而且在胶回收后用同样的条件跑，连条带都没有，目的片段大小1500bp
反应条件：94度 4min 94度 30s  52度30s  72 度 90s  72度10min  
该怎么优化呢？？

未命名.jpg



胶回收稀释后pcr.jpg
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1楼 2013-03-11 09:33:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1989zb: 金币+2 2013-03-13 07:47:48
第一、升高退货温度，应该可以做一个温度梯度，从而选择最适温度。可以选择55~65度
第二、减少引物量以及模板量
第三、适当加大1~2个循环数
第四、电泳检测的时候，不需要点20ul
第五、重新设计引物
祝你实验顺利
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总有一天我要修改用户名。
15楼2013-03-12 17:07:26
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woke2008

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1989zb: 金币+1 2013-03-13 07:47:44
把退货温度提高到58度~~引物少加点，不是越多越好~
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忘记了该怎么忘记该怎么办！
16楼2013-03-12 17:23:04
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普通回帖

lhs521521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1989zb: 金币+1 2013-03-13 07:48:18
杂带比较多，可以升高退火温度，比如做个touchdown PCR，或者梯度PCR，找到最适退火温度，再PCR！
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寻找真正的自我！
2楼2013-03-11 10:07:35
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1989zb

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lhs521521 at 2013-03-11 10:07:35
杂带比较多，可以升高退火温度，比如做个touchdown PCR，或者梯度PCR，找到最适退火温度，再PCR！

怎么才能让条带更亮呢
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3楼2013-03-11 10:44:30
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无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by 1989zb at 2013-03-11 10:44:30
怎么才能让条带更亮呢...

第一次做体系大一点，切目的条带，回收，以回收产物为模板再P，再结合优化PCR条件因该会好些！
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4楼2013-03-11 10:51:44
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1989zb

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-11 10:51:44
第一次做体系大一点，切目的条带，回收，以回收产物为模板再P，再结合优化PCR条件因该会好些！...

第二张图片就是胶回收在p  的 结果什么都没p 出来  不管是用胶回收原液或者稀释的都没p出来 郁闷的很
浓度不够没办法测序这才真郁闷了。
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5楼2013-03-11 11:01:11
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无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 1989zb at 2013-03-11 11:01:11
第二张图片就是胶回收在p  的 结果什么都没p 出来  不管是用胶回收原液或者稀释的都没p出来 郁闷的很
浓度不够没办法测序这才真郁闷了。...

看你第一个图的条带是可以回收到的，你回收不到可以让别人帮你做一次，做大孔胶，加大上样量，最后溶解时少加点TE或水。
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6楼2013-03-11 11:09:39
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生物大虫

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
非特异性条带太多并且很亮，我看了一下你的退火温度有点低，摸索PCR条件还不如重新设计引物
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谋事在人成事在天
7楼2013-03-11 14:38:33
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1989zb

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-11 11:09:39
看你第一个图的条带是可以回收到的，你回收不到可以让别人帮你做一次，做大孔胶，加大上样量，最后溶解时少加点TE或水。...

回收后电泳是有条带的  只是在次p 就p 不出来……
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8楼2013-03-11 14:41:14
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熊大斌

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！ 2013-03-11 20:39:21
PCR扩增的非特异性条带太多，要提高退火温度，提高个2~3度试试；还有你回收产物扩增的跑胶图片中，引物二聚体浓度太高，可以降低一下引物浓度试试。
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9楼2013-03-11 16:17:49
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
8楼: Originally posted by 1989zb at 2013-03-11 14:41:14
回收后电泳是有条带的  只是在次p 就p 不出来……...

回收后电泳不知道你上样量是多少，换句话说，回收后的浓度时多少。如果很低的话，干嘛要稀释那么多倍。我一般回收产物都不稀释的，直接p
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
10楼2013-03-11 18:51:43
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