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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 帮我看看PCR后的电泳条带，是否应该重新设计引物
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wurihan1983

铜虫 (小有名气)

[求助] 帮我看看PCR后的电泳条带，是否应该重新设计引物

目的条带为一千个bp左右，但是出现的条带上面两个 非常模糊，下面特别亮的应该是非特异性的吧？下一步我应该怎么做呢？需要重新设计引物吗？
或者改变一下PCR体系？

我用的是宝生物的taq酶，50ul
10×buffer   5u
dNTP           4u
模板           2u
引物1         1u
引物2        1u
taq酶         0.25u
ddH2O       36.75u

PCR为   94度    预变性5mn
             94度    45s
             55度    30s
             72度    1min（共35个循环）
             72度     10min延伸

IMG_5143.JPG
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1楼 2013-01-13 00:20:42
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回帖置顶 ( 共有1个 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-01-13 20:05:45
amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-13 20:05:49
最下面的是引物二聚体。引物的Tm值是多少？可以先尝试优化一下退火温度。marker用的是DL2000吗？上面的带也不是你要的吧。总之先用这对引物试试。做个退火温度梯度。
PCR的程序是可以的。你虽然给出了详细的反应体系，但没有各种组分的浓度，没办法确定用量是否合适。模板是什么？是否大致确定用量是多少？
此外，在试条件的时候PCR没必要做50μl体系，做20或者25μl就完全可以了。
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2楼2013-01-13 01:47:40
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普通回帖

wurihan1983

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-13 01:47:40
最下面的是引物二聚体。引物的Tm值是多少？可以先尝试优化一下退火温度。marker用的是DL2000吗？上面的带也不是你要的吧。总之先用这对引物试试。做个退火温度梯度。
PCR的程序是可以的。你虽然给出了详细的反应体 ...

marker我用的是DL2000的。上面的带很接近我的目的条带。所以我做了脱货温度梯度和模板浓度梯度。效果挺好。我的模板是无乳链球菌基因组DNA。我之前用的是索莱宝taq酶的一套。后来改成takara的了。还是后者好用啊。呵呵、谢谢您的回答。因为我还是新手，不知道如何给您两个金币！是系统自动转给您吗？
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3楼2013-01-17 23:41:22
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ZOEY21

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

最上面带在750吧，个人感觉引物、酶量大了
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4楼2013-01-18 09:20:31
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