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杨仔儿专家顾问
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PMD-19-t载体连接问题，真心求助 已有18人参与
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| 目的基因500多bp，pcr用的酶是：Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)，胶回收后连接，怎么都连接不上，求帮助。 |
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luwei13566
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-06-23 21:58:38
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-06-23 21:58:38
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转化后可以提质粒跑胶检测大小，那说明LZ的平板上还是长出来假阳性转化子了，平板上能有多少转化子？ T载体和连接酶都是新的还是在冰箱里放了很久的东西？ 1.如果转化子较多的话有必要做个蓝白斑筛选，筛查一下你的T载体有问题没有。以平板上深蓝色转化子作为计算自连率的标准。 2.如果转化子就那么几个，感受态做一个阳性对照，排除感受态的问题后，还是要从基因载体的浓度和比例以及连接条件上入手： 按照pmd18t的推荐体系：10ul体系：0.03pmol载体：0.1—0.3pmol基因+5ul solutionI 按照NEB的体系：20ul体系：0.02pmol载体：0.06pmol基因+10X T4 ligase buffer+1ul ligase 因此，你的基因如果真是70ng/ul的话,2ul就高达0.42pmol的浓度，基因过多反而会降低基因与载体的接触效率，其次我不知道LZ你的2Xbuffer从哪里来的，一般都是10Xbuffer，管子打开一股浓浓的DTT味道才对，连接buffer那么稀很难保证长期存放的效果。连接效率低的问题多半在此！ 至于连接条件的优化，如果遇到很难连接的体系，我一般会尝试二次连接，以Takara10ul连接体系为例，按照上述体系16度过夜连接，早上补加连接酶和连接buffer稀释到20ul，16度8h 或25度4h，下午3管并1管与感受态混合转化，转化子只多不少。 3. 如果上述筛查不解决问题的话，只能说明基因没加上A，将PCR产物加入rTaq及buffer 补加10mM dATP 72度30min加A处理！~ |
11楼2015-06-23 21:44:21
yudaoqian88
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