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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PMD-19-t载体连接问题，真心求助
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易水秋寒

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
25℃连接效率较低，试试16℃连接
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21楼2015-06-26 09:59:52
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-23 21:44:21
转化后可以提质粒跑胶检测大小，那说明LZ的平板上还是长出来假阳性转化子了，平板上能有多少转化子？ T载体和连接酶都是新的还是在冰箱里放了很久的东西？
1.如果转化子较多的话有必要做个蓝白斑筛选，筛查一下你的 ...

以Takara10ul连接体系为例，按照上述体系16度过夜连接，早上补加连接酶和连接buffer稀释到20ul，16度8h 或25度4h

这个连接酶和连接buffer不是在酶切之后连接表达载体的时候用吗，t连接也可以用吗

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22楼2015-06-28 14:24:05
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by yangjingjing at 2015-06-24 10:51:18
你确定切开了吗？回收的片段和载体酶切片段确定正确吗？

我还没到酶切的那一步，我用目的基因和t载体连接后，提质粒跑的核酸电泳，条带发现不对，应该是没连接上

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23楼2015-06-28 14:33:06
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by bright8 at 2015-06-25 21:35:22
你可以尝试一下用16℃连接，过夜效果应该好一点。我以前成功连接过5000bp片段。实在连接不上，你就直接送PCR产物测序吧，和18t测序没有多大的区别。

测什么，是把连接后提质粒的产物测序吗

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24楼2015-06-28 14:34:17
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xuebaobingyu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

这个酶会不会加poly a，好多高保真不加。不加你当然连不上

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25楼2015-06-28 14:34:59
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by xuebaobingyu at 2015-06-28 14:34:59
这个酶会不会加poly a，好多高保真不加。不加你当然连不上

用的是takara的Ex预混酶，带a尾巴

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26楼2015-06-28 15:00:33
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
24楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-06-28 14:34:17
测什么，是把连接后提质粒的产物测序吗
...

PCR产物测序！确定是否是你的目的序列。

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27楼2015-06-28 22:49:09
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被占了

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你确定买的是TAKARA公司的人pMD19-T？？
这种T载体里面有 solution I，直接做连接就好了，很方便的

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没有等出来的辉煌，只有做出来的成功。
28楼2015-06-28 22:55:20
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scenerytk

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可能是电泳出问题了

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29楼2015-06-28 23:12:16
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匿名

用户注销 (小有名气)
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30楼2015-06-29 00:47:39
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