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易水秋寒

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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25℃连接效率较低,试试16℃连接
21楼2015-06-26 09:59:52
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-23 21:44:21
转化后可以提质粒跑胶检测大小,那说明LZ的平板上还是长出来假阳性转化子了,平板上能有多少转化子? T载体和连接酶都是新的还是在冰箱里放了很久的东西?
1.如果转化子较多的话有必要做个蓝白斑筛选,筛查一下你的 ...

以Takara10ul连接体系为例,按照上述体系16度过夜连接,早上补加连接酶和连接buffer稀释到20ul,16度8h 或25度4h

这个连接酶和连接buffer不是在酶切之后连接表达载体的时候用吗,t连接也可以用吗

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22楼2015-06-28 14:24:05
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

引用回帖:
18楼: Originally posted by yangjingjing at 2015-06-24 10:51:18
你确定切开了吗?回收的片段和载体酶切片段确定正确吗?

我还没到酶切的那一步,我用目的基因和t载体连接后,提质粒跑的核酸电泳,条带发现不对,应该是没连接上

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23楼2015-06-28 14:33:06
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

引用回帖:
20楼: Originally posted by bright8 at 2015-06-25 21:35:22
你可以尝试一下用16℃连接,过夜效果应该好一点。我以前成功连接过5000bp片段。实在连接不上,你就直接送PCR产物测序吧,和18t测序没有多大的区别。

测什么,是把连接后提质粒的产物测序吗

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24楼2015-06-28 14:34:17
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xuebaobingyu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

这个酶会不会加poly a,好多高保真不加。不加你当然连不上

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25楼2015-06-28 14:34:59
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

引用回帖:
25楼: Originally posted by xuebaobingyu at 2015-06-28 14:34:59
这个酶会不会加poly a,好多高保真不加。不加你当然连不上

用的是takara的Ex预混酶,带a尾巴

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26楼2015-06-28 15:00:33
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
24楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-06-28 14:34:17
测什么,是把连接后提质粒的产物测序吗
...

PCR产物测序!确定是否是你的目的序列。

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27楼2015-06-28 22:49:09
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被占了

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你确定买的是TAKARA公司的人pMD19-T??
这种T载体里面有 solution I,直接做连接就好了,很方便的

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没有等出来的辉煌,只有做出来的成功。
28楼2015-06-28 22:55:20
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scenerytk

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可能是电泳出问题了

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29楼2015-06-28 23:12:16
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匿名

用户注销 (小有名气)

本帖仅楼主可见
30楼2015-06-29 00:47:39
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