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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PMD-19-t载体连接问题，真心求助
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
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28楼: Originally posted by 被占了 at 2015-06-28 22:55:20
你确定买的是TAKARA公司的人pMD19-T？？
这种T载体里面有 solution I，直接做连接就好了，很方便的

对，非常简单，但是就是做不出来

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31楼2015-06-29 14:15:18
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
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30楼: Originally posted by 永远元又 at 2015-06-29 00:47:39
提取的质粒直接跑电泳的条带是不准确的，多挑几个抗性平板上的单菌落，提取质粒后直接测序。

每次挑6个样，都是提质粒跑的，没测过

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32楼2015-06-29 14:16:40
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匿名

用户注销 (小有名气)
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33楼2015-06-29 23:49:29
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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22楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-06-28 14:24:05
以Takara10ul连接体系为例，按照上述体系16度过夜连接，早上补加连接酶和连接buffer稀释到20ul，16度8h 或25度4h

这个连接酶和连接buffer不是在酶切之后连接表达载体的时候用吗，t连接也可以用吗
...

1. 原来你所谓的2＊buffer就是solution I，那直接补加5ulsolution 1就可以了。
2. 不建议用Extaq连T载体,效果不好，可以用rTaq，序列较长可以用LA Taq扩增后连T载体。

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大家相互帮助哈
34楼2015-06-30 02:51:47
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qaz139687

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感觉你是不是买错了啊 我也用的是takara的PMD-19T载体，体系只要加1ul载体  4ulDNA  5ul  solution I 就好了，然后16℃连接过夜，感觉你加的东西好多 乱七八糟的
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35楼2015-06-30 16:57:20
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
34楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-30 02:51:47
1. 原来你所谓的2＊buffer就是solution I，那直接补加5ulsolution 1就可以了。
2. 不建议用Extaq连T载体,效果不好，可以用rTaq，序列较长可以用LA Taq扩增后连T载体。
...

不是，NEB公司的加2x的buffer,takara的直接4u目的基因,1u载体，5u solution 1 ，换过好多条件，就是连接不上，你说能不能是目的基因的问题，比如对载体有毒性或者其他

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36楼2015-06-30 17:04:56
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
35楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-06-30 16:57:20
感觉你是不是买错了啊 我也用的是takara的PMD-19T载体，体系只要加1ul载体  4ulDNA  5ul  solution I 就好了，然后16℃连接过夜，感觉你加的东西好多 乱七八糟的

我也这样做过，连接不上，能不能是目的基因的问题？

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37楼2015-06-30 17:05:42
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
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33楼: Originally posted by 永远元又 at 2015-06-29 23:49:29
测序看看，条带不准确的，我的就是这种情况。
...

嗯，👌

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38楼2015-06-30 17:05:58
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
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11楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-06-23 21:44:21
转化后可以提质粒跑胶检测大小，那说明LZ的平板上还是长出来假阳性转化子了，平板上能有多少转化子？ T载体和连接酶都是新的还是在冰箱里放了很久的东西？
1.如果转化子较多的话有必要做个蓝白斑筛选，筛查一下你的 ...

我用的是takara的Ex预混酶，带a尾巴的，那我可不可以在这个基础上再加一些a

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39楼2015-06-30 17:07:31
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
37楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-06-30 17:05:42
我也这样做过，连接不上，能不能是目的基因的问题？
...

你确定问题是出在连接上吗？也有可能是后面的原因呢 基因的问题一般很少吧 你做的是什么基因啊， 还有实在不行就直接送PCR产物测序吧，500bp用自己的上下引物双向测序基本都是正确的
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40楼2015-06-30 17:08:02
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