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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PMD-19-t载体连接问题，真心求助
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

[求助] PMD-19-t载体连接问题，真心求助 已有18人参与

目的基因500多bp，pcr用的酶是：Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)，胶回收后连接，怎么都连接不上，求帮助。
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1楼 2015-06-23 15:00:13
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-06-28 14:24:05
以Takara10ul连接体系为例，按照上述体系16度过夜连接，早上补加连接酶和连接buffer稀释到20ul，16度8h 或25度4h

这个连接酶和连接buffer不是在酶切之后连接表达载体的时候用吗，t连接也可以用吗
...

1. 原来你所谓的2＊buffer就是solution I，那直接补加5ulsolution 1就可以了。
2. 不建议用Extaq连T载体,效果不好，可以用rTaq，序列较长可以用LA Taq扩增后连T载体。

[ 发自小木虫客户端 ]
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大家相互帮助哈
34楼2015-06-30 02:51:47
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
能不能说的具体点，你这样描述没法找原因啊。
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123456
2楼2015-06-23 15:07:30
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiqinger at 2015-06-23 15:07:30
能不能说的具体点，你这样描述没法找原因啊。

我用的是takara公司的Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)酶p我的目的基因（500多bp），之后胶回收，浓度在70ng/ul左右，用胶回收的目的基因和pmd-18载体连接，用NEB公司的连接酶10ul体系：载体1ul，目的基因2ul，2X的buffer 5ul，DNA连接酶 0.5ul，水1.5ul，在25度温度下连接2h，做菌液PCR没有条带，提质粒跑核酸电泳，用空载体对照，结果条带显示一致，就是没连接上。我也用过takara的连接体系，过夜连接，结果都是没连接上。
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3楼2015-06-23 15:44:56
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
就没有告诉一下的，
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4楼2015-06-23 16:10:29
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