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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PMD-19-t载体连接问题，真心求助
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
40楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-06-30 17:08:02
你确定问题是出在连接上吗？也有可能是后面的原因呢 基因的问题一般很少吧 你做的是什么基因啊， 还有实在不行就直接送PCR产物测序吧，500bp用自己的上下引物双向测序基本都是正确的...

后边除了转化，涂板，挑单克隆，摇菌，提质粒，谢谢我都快背下来了，这些步骤应该没错，我老师说测序，基因的前后50个基因测的可能不准，也像你说的基因的问题可能性不大

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41楼2015-06-30 17:37:15
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
41楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-06-30 17:37:15
后边除了转化，涂板，挑单克隆，摇菌，提质粒，谢谢我都快背下来了，这些步骤应该没错，我老师说测序，基因的前后50个基因测的可能不准，也像你说的基因的问题可能性不大
...

你双向测序，800bp以内都是准的，可以试试
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

杨仔儿
42楼2015-07-01 09:53:11
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
42楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-07-01 09:53:11
你双向测序，800bp以内都是准的，可以试试...

好的，，谢谢！！！！

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43楼2015-07-01 11:33:48
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againr

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你好，不知道你现在做出来没有，我以前也是做不出来，我的目的片段2184bp，18T，19T都没连上，浪费好多载体，不断优化各种条件，有一点心得，因为是TA克隆，连接效率是很高的，最最大的可能就是目的基因上最后的A尾没有加上，刚开始我的PCR反应条件是最后72度10min，但是这个条件下，我的目的基因和T载体从来没有连上过，直到我把72度10min改成72度20min之后，就连成功了，而且阳性率很高，我个人觉得你可以试试，还有就是和自己的用的mix和基因结构貌似也有点忙关系，希望对你有所帮助！
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44楼2016-09-13 11:21:19
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叶∏_∏

新虫 (小有名气)
引用回帖:
31楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-06-29 14:15:18
对，非常简单，但是就是做不出来
...

现在我也遇到了相同的问题，一直连不上，后来给师兄同时做的，结果师兄的做出来了，我的就依然还是没有，，，话说楼主最后怎么办了？

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45楼2017-06-06 00:17:27
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
45楼: Originally posted by 叶∏_∏ at 2017-06-06 00:17:27
现在我也遇到了相同的问题，一直连不上，后来给师兄同时做的，结果师兄的做出来了，我的就依然还是没有，，，话说楼主最后怎么办了？
...

话说都是2年前了，真的记不清了。不好意思

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46楼2017-06-08 23:51:23
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叶∏_∏

新虫 (小有名气)
引用回帖:
46楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2017-06-08 23:51:23
话说都是2年前了，真的记不清了。不好意思
...

来晚了

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47楼2017-06-12 04:34:23
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