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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PMD-19-t载体连接问题，真心求助
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

[求助] PMD-19-t载体连接问题，真心求助 已有18人参与

目的基因500多bp，pcr用的酶是：Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)，胶回收后连接，怎么都连接不上，求帮助。
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1楼 2015-06-23 15:00:13
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againr

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你好，不知道你现在做出来没有，我以前也是做不出来，我的目的片段2184bp，18T，19T都没连上，浪费好多载体，不断优化各种条件，有一点心得，因为是TA克隆，连接效率是很高的，最最大的可能就是目的基因上最后的A尾没有加上，刚开始我的PCR反应条件是最后72度10min，但是这个条件下，我的目的基因和T载体从来没有连上过，直到我把72度10min改成72度20min之后，就连成功了，而且阳性率很高，我个人觉得你可以试试，还有就是和自己的用的mix和基因结构貌似也有点忙关系，希望对你有所帮助！
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44楼2016-09-13 11:21:19
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
能不能说的具体点，你这样描述没法找原因啊。
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2楼2015-06-23 15:07:30
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiqinger at 2015-06-23 15:07:30
能不能说的具体点，你这样描述没法找原因啊。

我用的是takara公司的Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)酶p我的目的基因（500多bp），之后胶回收，浓度在70ng/ul左右，用胶回收的目的基因和pmd-18载体连接，用NEB公司的连接酶10ul体系：载体1ul，目的基因2ul，2X的buffer 5ul，DNA连接酶 0.5ul，水1.5ul，在25度温度下连接2h，做菌液PCR没有条带，提质粒跑核酸电泳，用空载体对照，结果条带显示一致，就是没连接上。我也用过takara的连接体系，过夜连接，结果都是没连接上。
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3楼2015-06-23 15:44:56
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杨仔儿

木虫 (著名写手)
就没有告诉一下的，
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4楼2015-06-23 16:10:29
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