应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PMD-19-t载体连接问题，真心求助
471/5返回列表12345下一页
查看: 3965  |  回复: 46
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

杨仔儿

木虫 (著名写手)

[求助] PMD-19-t载体连接问题，真心求助 已有18人参与

目的基因500多bp，pcr用的酶是：Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)，胶回收后连接，怎么都连接不上，求帮助。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-06-23 15:00:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-06-23 21:58:38
转化后可以提质粒跑胶检测大小，那说明LZ的平板上还是长出来假阳性转化子了，平板上能有多少转化子？ T载体和连接酶都是新的还是在冰箱里放了很久的东西？
1.如果转化子较多的话有必要做个蓝白斑筛选，筛查一下你的T载体有问题没有。以平板上深蓝色转化子作为计算自连率的标准。
2.如果转化子就那么几个，感受态做一个阳性对照，排除感受态的问题后，还是要从基因载体的浓度和比例以及连接条件上入手：
按照pmd18t的推荐体系：10ul体系：0.03pmol载体：0.1—0.3pmol基因+5ul solutionI  
按照NEB的体系：20ul体系：0.02pmol载体：0.06pmol基因+10X T4 ligase buffer+1ul ligase
因此，你的基因如果真是70ng/ul的话,2ul就高达0.42pmol的浓度，基因过多反而会降低基因与载体的接触效率，其次我不知道LZ你的2Xbuffer从哪里来的，一般都是10Xbuffer，管子打开一股浓浓的DTT味道才对，连接buffer那么稀很难保证长期存放的效果。连接效率低的问题多半在此！
      至于连接条件的优化，如果遇到很难连接的体系，我一般会尝试二次连接，以Takara10ul连接体系为例，按照上述体系16度过夜连接，早上补加连接酶和连接buffer稀释到20ul，16度8h 或25度4h，下午3管并1管与感受态混合转化，转化子只多不少。
3. 如果上述筛查不解决问题的话，只能说明基因没加上A，将PCR产物加入rTaq及buffer 补加10mM dATP 72度30min加A处理！~
赞一下(1人) 回复此楼
大家相互帮助哈
11楼2015-06-23 21:44:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接时间不是问题，因为基因不大，体系也不是大问题，因为是做TA克隆…可以这样再试试…
1回收产物要加a
2换用新的T载体
3连接体系在加等量的solution1之前可以50度   5分钟，后冰上五分钟…
4尝试PCR产物直接回收，不切胶…
5菌液PCR检测用载体通用引物更稳定…提取质粒也不便直接跑较检测，而要用酶切检测的方法…祝好运…

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下(1人) 回复此楼
特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
14楼2015-06-23 22:23:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sundan611

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:07:41
回收模板浓度没问题的话，你就用宝生物的与PMD18T配套的buffer和连接酶，不用NEB的，
载体1ul 目的片段4ul 水5ul 16度连接过夜 连接做一个阳性对照 PMD18T试剂盒里有一个阳性对照
确定感受态没有问题
赞一下(1人) 回复此楼
17楼2015-06-24 08:53:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

li201018

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:07:10
胶回收产物一定要定量，按照载体：回收产物为1:3-1:10之间都好，最好16度过夜链接，10微升连接体系。祝好运！
赞一下(1人) 回复此楼
低调！务实！
19楼2015-06-24 11:18:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
能不能说的具体点，你这样描述没法找原因啊。
赞一下 回复此楼
123456
2楼2015-06-23 15:07:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiqinger at 2015-06-23 15:07:30
能不能说的具体点，你这样描述没法找原因啊。

我用的是takara公司的Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)酶p我的目的基因（500多bp），之后胶回收，浓度在70ng/ul左右，用胶回收的目的基因和pmd-18载体连接，用NEB公司的连接酶10ul体系：载体1ul，目的基因2ul，2X的buffer 5ul，DNA连接酶 0.5ul，水1.5ul，在25度温度下连接2h，做菌液PCR没有条带，提质粒跑核酸电泳，用空载体对照，结果条带显示一致，就是没连接上。我也用过takara的连接体系，过夜连接，结果都是没连接上。
赞一下 回复此楼
3楼2015-06-23 15:44:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

杨仔儿

木虫 (著名写手)
就没有告诉一下的，
赞一下 回复此楼
4楼2015-06-23 16:10:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

杨仔儿

木虫 (著名写手)
好心人都去哪了
回复此楼
5楼2015-06-23 16:10:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flyy1986

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
洗脱buffer有没有用含EDTA的溶液

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
6楼2015-06-23 17:19:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

杨仔儿

木虫 (著名写手)
有没有知道为什么的大神

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2015-06-23 17:20:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by flyy1986 at 2015-06-23 17:19:41
洗脱buffer有没有用含EDTA的溶液

哪一步洗脱？

[ 发自小木虫客户端 ]
回复此楼
8楼2015-06-23 17:26:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

杨仔儿

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by flyy1986 at 2015-06-23 17:19:41
洗脱buffer有没有用含EDTA的溶液

胶回收和提质粒都直接用的无RNA酶水洗脱的

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
9楼2015-06-23 17:28:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-23 21:58:01
载体1微升，回收产物4微升体系试试。用漂洗液洗完回收柱后要充分晾干再洗脱。
赞一下 回复此楼
10楼2015-06-23 20:20:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 杨仔儿 的主题更新
471/5返回列表12345下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭