应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物加尾之后连接载体的问题
131/2返回列表12下一页
查看: 3330  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xmccphx

铜虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物加尾之后连接载体的问题 已有5人参与

使用TOYOBO公司的KOD FX酶扩增大约2.5kb的目的片段，由于要连到PMD-19T载体上，需要对PCR产物加尾。以下是我的实验步骤，请教一下有没有问题：
①PCR产物跑胶后切胶回收；②将回收的产物使用rTAQ酶体系72℃水浴保温30min加尾，③加尾后的产物4ul，soultion I 5ul，PMD-19T simple 1ul，混合后16℃水浴过夜。 连接之后的产物跑胶后发现片段大小只是原来扩增的片段，请问是哪里出问题了？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-05-11 21:53:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

draco1987

木虫 (正式写手)
连接完直接转化啊，跑什么胶啊。长出菌落再检测就好了，出不出全凭信仰，只要有一个阳性克隆就是胜利
你连接个T载体都这么小心谨慎的，以后就是要把自己逼死的节奏啊
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2015-05-13 11:36:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
????K????????z??????A???????????PCR?w????Aβ

[ ????С??????? ]
赞一下 回复此楼
天道酬勤
2楼2015-05-11 22:46:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
链接之后的产物跑胶？是指连接PMD-19T载体之后跑胶大小还是加尾后跑胶啊，链接载体后跑胶，引物不变扩增的片段当然不变了
赞一下 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-05-12 09:08:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接后10ul的体系做检测还能检测出基因那说明LZ的基因浓度不低，那跑胶能看到T载体的带吗？
其实我建议LZ就拿这个体系做一下转化试试运气，因为本身在常规buffer下rTaq加A效率就不高，估计有连上T载体的但是达不到琼脂糖凝胶的分辨率你肉眼看不到而已，连出来空载可能会比较多。
要想提高rTaq的加A效率，可以把dNTP换成dATP，用rTaq，其他体系不变，连接72度30min——60min。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
4楼2015-05-12 16:56:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmccphx

铜虫 (初入文坛)
???????:
2?: Originally posted by ?????11 at 2015-05-11 22:46:06
????K????????z??????A???????????PCR?w????Aβ

?????PCR?????β????
赞一下 回复此楼
5楼2015-05-12 22:59:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmccphx

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-05-12 09:08:01
链接之后的产物跑胶？是指连接PMD-19T载体之后跑胶大小还是加尾后跑胶啊，链接载体后跑胶，引物不变扩增的片段当然不变了

是加尾后的PCR产物与PMD-19T载体连接之后的产物跑胶。连接产物不是直接跑胶看大小是否符合预期嘛？还要再扩增吗？
赞一下 回复此楼
6楼2015-05-12 23:07:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmccphx

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-12 16:56:42
连接后10ul的体系做检测还能检测出基因那说明LZ的基因浓度不低，那跑胶能看到T载体的带吗？
其实我建议LZ就拿这个体系做一下转化试试运气，因为本身在常规buffer下rTaq加A效率就不高，估计有连上T载体的但是达不到 ...

嗯，好的，谢谢！做转化看看
赞一下 回复此楼
7楼2015-05-12 23:08:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xmccphx at 2015-05-12 23:08:18
嗯，好的，谢谢！做转化看看...

用30ul连接产物和200ul感受态细胞混合涂版，可能会有很多T载体的自连，所以挑转化子的时候多挑一些，拼你运气的时候到了~~
如果没有阳性转化子，那就买dATP加A，一般的dNTP加A效果真心很差。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
8楼2015-05-12 23:23:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
引用回帖:
6楼: Originally posted by xmccphx at 2015-05-12 23:07:32
是加尾后的PCR产物与PMD-19T载体连接之后的产物跑胶。连接产物不是直接跑胶看大小是否符合预期嘛？还要再扩增吗？...

哦哦，我理解错了
回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
9楼2015-05-13 10:00:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接平端载体嘛，费这个劲干什么呢
赞一下 回复此楼
10楼2015-05-13 11:17:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xmccphx 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[基金申请] 面上意见出来了 +9 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 18/900 2026-08-30 16:47 by 黄鸟于飞Chao
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭