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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物加尾之后连接载体的问题
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xmccphx

铜虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物加尾之后连接载体的问题已有5人参与

使用TOYOBO公司的KOD FX酶扩增大约2.5kb的目的片段，由于要连到PMD-19T载体上，需要对PCR产物加尾。以下是我的实验步骤，请教一下有没有问题：
①PCR产物跑胶后切胶回收；②将回收的产物使用rTAQ酶体系72℃水浴保温30min加尾，③加尾后的产物4ul，soultion I 5ul，PMD-19T simple 1ul，混合后16℃水浴过夜。 连接之后的产物跑胶后发现片段大小只是原来扩增的片段，请问是哪里出问题了？
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1楼2015-05-11 21:53:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

draco1987

木虫 (正式写手)
连接完直接转化啊，跑什么胶啊。长出菌落再检测就好了，出不出全凭信仰，只要有一个阳性克隆就是胜利
你连接个T载体都这么小心谨慎的，以后就是要把自己逼死的节奏啊
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11楼2015-05-13 11:36:57
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其�??K不需要跑膠之後再加A，可以直接在PCR體系里加A尾

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
2楼2015-05-11 22:46:06
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
链接之后的产物跑胶？是指连接PMD-19T载体之后跑胶大小还是加尾后跑胶啊，链接载体后跑胶，引物不变扩增的片段当然不变了
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-05-12 09:08:01
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接后10ul的体系做检测还能检测出基因那说明LZ的基因浓度不低，那跑胶能看到T载体的带吗？
其实我建议LZ就拿这个体系做一下转化试试运气，因为本身在常规buffer下rTaq加A效率就不高，估计有连上T载体的但是达不到琼脂糖凝胶的分辨率你肉眼看不到而已，连出来空载可能会比较多。
要想提高rTaq的加A效率，可以把dNTP换成dATP，用rTaq，其他体系不变，连接72度30min——60min。
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大家相互帮助哈
4楼2015-05-12 16:56:42
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xmccphx

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2015-05-11 22:46:06
其�??K不需要跑膠之後再加A，可以直接在PCR體系里加A尾

直接用PCR产物加尾是吧？
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5楼2015-05-12 22:59:18
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xmccphx

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-05-12 09:08:01
链接之后的产物跑胶？是指连接PMD-19T载体之后跑胶大小还是加尾后跑胶啊，链接载体后跑胶，引物不变扩增的片段当然不变了

是加尾后的PCR产物与PMD-19T载体连接之后的产物跑胶。连接产物不是直接跑胶看大小是否符合预期嘛？还要再扩增吗？
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6楼2015-05-12 23:07:32
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xmccphx

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-12 16:56:42
连接后10ul的体系做检测还能检测出基因那说明LZ的基因浓度不低，那跑胶能看到T载体的带吗？
其实我建议LZ就拿这个体系做一下转化试试运气，因为本身在常规buffer下rTaq加A效率就不高，估计有连上T载体的但是达不到 ...

嗯，好的，谢谢！做转化看看
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7楼2015-05-12 23:08:18
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xmccphx at 2015-05-12 23:08:18
嗯，好的，谢谢！做转化看看...

用30ul连接产物和200ul感受态细胞混合涂版，可能会有很多T载体的自连，所以挑转化子的时候多挑一些，拼你运气的时候到了~~
如果没有阳性转化子，那就买dATP加A，一般的dNTP加A效果真心很差。
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大家相互帮助哈
8楼2015-05-12 23:23:07
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
引用回帖:
6楼: Originally posted by xmccphx at 2015-05-12 23:07:32
是加尾后的PCR产物与PMD-19T载体连接之后的产物跑胶。连接产物不是直接跑胶看大小是否符合预期嘛？还要再扩增吗？...

哦哦，我理解错了
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
9楼2015-05-13 10:00:18
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接平端载体嘛，费这个劲干什么呢
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10楼2015-05-13 11:17:36
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