应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物加尾之后连接载体的问题
51/1返回列表
查看: 2843  |  回复: 12
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

xmccphx

铜虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物加尾之后连接载体的问题已有5人参与

使用TOYOBO公司的KOD FX酶扩增大约2.5kb的目的片段，由于要连到PMD-19T载体上，需要对PCR产物加尾。以下是我的实验步骤，请教一下有没有问题：
①PCR产物跑胶后切胶回收；②将回收的产物使用rTAQ酶体系72℃水浴保温30min加尾，③加尾后的产物4ul，soultion I 5ul，PMD-19T simple 1ul，混合后16℃水浴过夜。 连接之后的产物跑胶后发现片段大小只是原来扩增的片段，请问是哪里出问题了？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2015-05-11 21:53:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmccphx

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2015-05-11 22:46:06
其�??K不需要跑膠之後再加A，可以直接在PCR體系里加A尾

直接用PCR产物加尾是吧？
赞一下 回复此楼
5楼2015-05-12 22:59:18
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其�??K不需要跑膠之後再加A，可以直接在PCR體系里加A尾

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
天道酬勤
2楼2015-05-11 22:46:06
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
链接之后的产物跑胶？是指连接PMD-19T载体之后跑胶大小还是加尾后跑胶啊，链接载体后跑胶，引物不变扩增的片段当然不变了
赞一下 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-05-12 09:08:01
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接后10ul的体系做检测还能检测出基因那说明LZ的基因浓度不低，那跑胶能看到T载体的带吗？
其实我建议LZ就拿这个体系做一下转化试试运气，因为本身在常规buffer下rTaq加A效率就不高，估计有连上T载体的但是达不到琼脂糖凝胶的分辨率你肉眼看不到而已，连出来空载可能会比较多。
要想提高rTaq的加A效率，可以把dNTP换成dATP，用rTaq，其他体系不变，连接72度30min——60min。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
4楼2015-05-12 16:56:42
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭