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xmccphx

铜虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物加尾之后连接载体的问题 已有5人参与

使用TOYOBO公司的KOD FX酶扩增大约2.5kb的目的片段,由于要连到PMD-19T载体上,需要对PCR产物加尾。以下是我的实验步骤,请教一下有没有问题:
①PCR产物跑胶后切胶回收;②将回收的产物使用rTAQ酶体系72℃水浴保温30min加尾,③加尾后的产物4ul,soultion I 5ul,PMD-19T simple 1ul,混合后16℃水浴过夜。 连接之后的产物跑胶后发现片段大小只是原来扩增的片段,请问是哪里出问题了?
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by xmccphx at 2015-05-12 23:08:18
嗯,好的,谢谢!做转化看看...

用30ul连接产物和200ul感受态细胞混合涂版,可能会有很多T载体的自连,所以挑转化子的时候多挑一些,拼你运气的时候到了~~
如果没有阳性转化子,那就买dATP加A,一般的dNTP加A效果真心很差。
大家相互帮助哈
8楼2015-05-12 23:23:07
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查看全部 13 个回答

随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
????K????????z??????A???????????PCR?w????Aβ

[ ????С??????? ]
天道酬勤
2楼2015-05-11 22:46:06
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
链接之后的产物跑胶?是指连接PMD-19T载体之后跑胶大小还是加尾后跑胶啊,链接载体后跑胶,引物不变扩增的片段当然不变了
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-05-12 09:08:01
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
连接后10ul的体系做检测还能检测出基因那说明LZ的基因浓度不低,那跑胶能看到T载体的带吗?
其实我建议LZ就拿这个体系做一下转化试试运气,因为本身在常规buffer下rTaq加A效率就不高,估计有连上T载体的但是达不到琼脂糖凝胶的分辨率你肉眼看不到而已,连出来空载可能会比较多。
要想提高rTaq的加A效率,可以把dNTP换成dATP,用rTaq,其他体系不变,连接72度30min——60min。
大家相互帮助哈
4楼2015-05-12 16:56:42
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