应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物A加尾
161/2返回列表12下一页
查看: 3099  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物A加尾

我是用Phusion 高保真酶做的PCR，但所用的载体是TA载体，所以需要A加尾。第一次我是这样做的：先用试剂盒将PCR产物纯化，然后加buffer, Taq, dATP，但是没有加上。后来分析可能是保真酶的内切酶活性还存在，于是就用酚、氯仿 将PCR 纯化，然后进行A加尾，但还是失败了。本来以为这是很简单的事情，但折腾了很久了。所以在此请教大家：究竟怎么样才能加上A尾巴？是否有既可以加上A又具有保真性的酶呢？因为要构建超表达载体，所以必须是保真的。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-11-03 05:56:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

anlewo7777

木虫 (正式写手)
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:06
直接用Taq的体系，用dNTP，保温72度30分钟就行了
赞一下 回复此楼
2楼2010-11-03 07:27:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zzq770204

至尊木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-03 08:44:13
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:12
gdongli8325(金币+3): 2011-04-26 00:34:32
所有循环结束后，暂停反应，在反应体系中加少量taq酶，72℃40min即可。

用高保真酶正常PCR结束之后，加入taq酶及其相应buffer，72℃半小时即可！
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-11-03 07:51:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-03 08:44:21
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:16
推荐步骤：1. PCR产物回收。 2. 常规的加A步骤。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-11-03 08:42:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:21
高保真酶正常PCR结束后，加入Taq酶及其相应buffer，72℃半小时即可！
赞一下 回复此楼
5楼2010-11-03 08:56:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lstt09nk(金币+1):感谢交流 2010-11-03 12:57:10
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:26
高保真酶怎么有内切酶活性了？
只是当发生错配时有3-5外切酶的活性而已
不影响你加A
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2010-11-03 09:31:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyong1981

金虫 (正式写手)
很多人说的对~
回复此楼
7楼2010-11-03 09:43:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xulanzzz

金虫 (著名写手)
★
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-03 12:56:48
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:32
呵呵 我们现在用的T载体不需要A尾巴，直接用KOD酶进行PCR，PCR产物直接进行T载体连接就可以。pBM19-B载体就可以实现平末端直接连接，可以买这个试试。
赞一下(1人) 回复此楼
DOBEST
8楼2010-11-03 10:15:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:41
二楼的方法应该行，如果不放心，用Taq酶重新扩一遍就好了
赞一下 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
9楼2010-11-03 11:04:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:45
是外切酶活性
回复此楼
10楼2010-11-03 12:33:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 gdongli8325 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 化学工程321分求调剂 +10 大米饭！ 2026-03-15 13/650 2026-03-17 06:57 by laoshidan
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +3 Losir 2026-03-12 4/200 2026-03-16 21:52 by Losir
[考研] 材料专硕306英一数二 +4 z1z2z3879 2026-03-16 6/300 2026-03-16 19:38 by z1z2z3879
[考研] 化学调剂0703 +8 啊我我的 2026-03-11 8/400 2026-03-16 17:23 by 我的船我的海
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +12 不知道叫什么！ 2026-03-15 14/700 2026-03-16 16:45 by 我的船我的海
[考研] 0703一志愿211 285分求调剂 +5 ly3471z 2026-03-13 5/250 2026-03-16 16:16 by 哦哦123
[考研] 085600调剂 +5 漾漾123sun 2026-03-12 6/300 2026-03-16 15:58 by 漾漾123sun
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化，一志愿：哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
[考研] 0703化学调剂 +4 快乐的香蕉 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:41 by JourneyLucky
[考研] ［0860］321分求调剂，ab区皆可 +4 宝贵热 2026-03-13 4/200 2026-03-13 22:01 by 星空星月
[考研] 0856材料与化工301求调剂 +5 奕束光 2026-03-13 5/250 2026-03-13 22:00 by 星空星月
[考研] 26调剂/材料/英一数二/总分289/已过A区线 +6 步川酷紫123 2026-03-13 6/300 2026-03-13 21:59 by 星空星月
[考研] 四川大学085601材料工程专硕 初试294求调剂 +4 祝我们好在冬天 2026-03-11 4/200 2026-03-13 21:39 by peike
[考研] 26调剂/材料科学与工程/总分295/求收留 +9 2026调剂侠 2026-03-12 9/450 2026-03-13 20:46 by 18595523086
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 0703化学求调剂 +7 绿豆芹菜汤 2026-03-12 7/350 2026-03-13 17:25 by njzyff
[考研] 材料专硕350 求调剂 +4 王金科 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:02 by ruiyingmiao
[考研] 材料专硕274一志愿陕西师范大学求调剂 +4 薛云鹏 2026-03-13 4/200 2026-03-13 10:40 by 学员8dgXkO
[考博] 读博申请 +5 感dd 2026-03-10 7/350 2026-03-11 17:02 by QGZDSYS
[考研] 0703化学调剂 +3 三dd. 2026-03-10 3/150 2026-03-10 15:45 by peike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭