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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物A加尾
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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物A加尾

我是用Phusion 高保真酶做的PCR，但所用的载体是TA载体，所以需要A加尾。第一次我是这样做的：先用试剂盒将PCR产物纯化，然后加buffer, Taq, dATP，但是没有加上。后来分析可能是保真酶的内切酶活性还存在，于是就用酚、氯仿 将PCR 纯化，然后进行A加尾，但还是失败了。本来以为这是很简单的事情，但折腾了很久了。所以在此请教大家：究竟怎么样才能加上A尾巴？是否有既可以加上A又具有保真性的酶呢？因为要构建超表达载体，所以必须是保真的。
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1楼 2010-11-03 05:56:01
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anlewo7777

木虫 (正式写手)
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:06
直接用Taq的体系，用dNTP，保温72度30分钟就行了
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2楼2010-11-03 07:27:00
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zzq770204

至尊木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-03 08:44:13
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:12
gdongli8325(金币+3): 2011-04-26 00:34:32
所有循环结束后，暂停反应，在反应体系中加少量taq酶，72℃40min即可。

用高保真酶正常PCR结束之后，加入taq酶及其相应buffer，72℃半小时即可！
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3楼2010-11-03 07:51:17
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-03 08:44:21
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:16
推荐步骤：1. PCR产物回收。 2. 常规的加A步骤。
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4楼2010-11-03 08:42:35
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:21
高保真酶正常PCR结束后，加入Taq酶及其相应buffer，72℃半小时即可！
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5楼2010-11-03 08:56:01
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lstt09nk(金币+1):感谢交流 2010-11-03 12:57:10
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:26
高保真酶怎么有内切酶活性了？
只是当发生错配时有3-5外切酶的活性而已
不影响你加A
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6楼2010-11-03 09:31:12
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liyong1981

金虫 (正式写手)
很多人说的对~
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7楼2010-11-03 09:43:21
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
★
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-03 12:56:48
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:32
呵呵 我们现在用的T载体不需要A尾巴，直接用KOD酶进行PCR，PCR产物直接进行T载体连接就可以。pBM19-B载体就可以实现平末端直接连接，可以买这个试试。
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DOBEST
8楼2010-11-03 10:15:11
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:41
二楼的方法应该行，如果不放心，用Taq酶重新扩一遍就好了
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
9楼2010-11-03 11:04:36
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:45
是外切酶活性
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10楼2010-11-03 12:33:57
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