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gdongli8325

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物A加尾

我是用Phusion 高保真酶做的PCR,但所用的载体是TA载体,所以需要A加尾。第一次我是这样做的:先用试剂盒将PCR产物纯化,然后加buffer, Taq, dATP,但是没有加上。后来分析可能是保真酶的内切酶活性还存在,于是就用酚、氯仿 将PCR 纯化,然后进行A加尾,但还是失败了。本来以为这是很简单的事情,但折腾了很久了。所以在此请教大家:究竟怎么样才能加上A尾巴?是否有既可以加上A又具有保真性的酶呢?因为要构建超表达载体,所以必须是保真的。
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xulanzzz

金虫 (著名写手)


lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-03 12:56:48
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:32
呵呵 我们现在用的T载体不需要A尾巴,直接用KOD酶进行PCR,PCR产物直接进行T载体连接就可以。pBM19-B载体就可以实现平末端直接连接,可以买这个试试。
DOBEST
8楼2010-11-03 10:15:11
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:06
直接用Taq的体系,用dNTP,保温72度30分钟就行了
2楼2010-11-03 07:27:00
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zzq770204

至尊木虫 (著名写手)


dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-03 08:44:13
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:12
gdongli8325(金币+3): 2011-04-26 00:34:32
所有循环结束后,暂停反应,在反应体系中加少量taq酶,72℃40min即可。

用高保真酶正常PCR结束之后,加入taq酶及其相应buffer,72℃半小时即可!
3楼2010-11-03 07:51:17
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)


dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-03 08:44:21
gdongli8325(金币+1): 2010-11-14 20:39:16
推荐步骤:1. PCR产物回收。 2. 常规的加A步骤。
4楼2010-11-03 08:42:35
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