24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

xmccphx

铜虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 57.5
帖子: 31
在线: 11.9小时
虫号: 2849948
注册: 2013-12-05
专业: 生物大分子结构与功能

[求助] PCR产物加尾之后连接载体的问题已有5人参与

使用TOYOBO公司的KOD FX酶扩增大约2.5kb的目的片段，由于要连到PMD-19T载体上，需要对PCR产物加尾。以下是我的实验步骤，请教一下有没有问题：
①PCR产物跑胶后切胶回收；②将回收的产物使用rTAQ酶体系72℃水浴保温30min加尾，③加尾后的产物4ul，soultion I 5ul，PMD-19T simple 1ul，混合后16℃水浴过夜。连接之后的产物跑胶后发现片段大小只是原来扩增的片段，请问是哪里出问题了？

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

求赐教，扩增3000bp片段是用高保真Taq酶好，还是用高保真再加A尾好一点？已经有27人回复
PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解? 已经有14人回复
PCR产物连T载体转化后，阳性率低已经有9人回复
pcr产物末端加A问题已经有23人回复
合成的引物直接退火形成粘性末端后连入载体已经有13人回复
平末端加A尾连接T载体的问题已经有14人回复
关于构载体过程中PCR验证正确但是测序为空载体的困惑已经有7人回复
片段总是连不到T载体上已经有22人回复
目的片段和T载体连接后PCR条带诡异已经有16人回复
pcr产物胶回收浓度低，能不能和T载体连接已经有16人回复
大侠们，帮我看一下这对引物的酶切位点是什么？已经有20人回复
PCR片段与载体连接不上已经有6人回复
急!要连表达载体的目的片段可以是PCR后回收的产物吗？已经连中间载体验证过了已经有3人回复
高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上已经有26人回复
载体连接pcr片段一直连不上已经有17人回复
兼并引物PCR连T载体后，怎么鉴定有没有连上已经有20人回复
PCR产物与T载体连不上求助已经有29人回复
关于PCR产物与pMD 19Tsimple连接的问题已经有19人回复
【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体已经有26人回复
【求助/交流】PCR产物A加尾已经有15人回复
【求助/交流】PCR产物与T载体的连接的实验原理？已经有5人回复

1楼 2015-05-11 21:53:15

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

MolEPI: 3
应助: 184 (高中生)
金币: 4350.4
散金: 97
红花: 35
帖子: 641
在线: 261.1小时
虫号: 2380655
注册: 2013-03-27
性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

连接后10ul的体系做检测还能检测出基因那说明LZ的基因浓度不低，那跑胶能看到T载体的带吗？
其实我建议LZ就拿这个体系做一下转化试试运气，因为本身在常规buffer下rTaq加A效率就不高，估计有连上T载体的但是达不到琼脂糖凝胶的分辨率你肉眼看不到而已，连出来空载可能会比较多。
要想提高rTaq的加A效率，可以把dNTP换成dATP，用rTaq，其他体系不变，连接72度30min——60min。