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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PCR产物连T载体转化后，阳性率低
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windleakey

金虫 (小有名气)

[求助] PCR产物连T载体转化后，阳性率低 已有3人参与

RT，最近实验发现，PCR产物经纯化后连T载体，转化后阳性率总是很低，挑10个单克隆做PCR可能只有一个是阳性的，虽然能得到想要的，但还是觉得很奇怪，不知道是什么原因。
请问有大神知道吗？
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1楼 2014-03-22 22:50:19
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回帖置顶 ( 共有1个 )

tu475575025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
windleakey: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-03-24 12:32:05
gyesang: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 19:58:23
没有遇到过这种情况，连T载体效率相当高，经常会做，每次随便挑一个白斑就是阳性，后来索性不用怎么验证了。你可以从以下方面一个个排查：
1、感受态和转化方法，用完整的质粒转化试试，如果转化效率很高，说明这部分没有问题。
2、确认你做pcr的酶是不是会加A，如果是的，再查下一项。
3、用T载自带的control insert 连接T截试试，如果出现效率很低，可能就是你的T截或者solution I 出问题了。
4、再要排查就要换新的T载和solution I试试了
ps：你说每次要挑10来个转化子才有一个阳性，转化子很多嘛，说明你的转化效率还是很高，只是很多是载体自连而已，这个可以用蓝白斑来排除呀。猜测是你连接时T载用量过多，插入片段量少了（如果T载正常全部是线性）。也可能是你的载体出问题了，连接前就有很多已经环化了（可以直接转1ul 没有连接的T载试试）。
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9楼2014-03-23 21:32:29
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)
蓝白斑筛选了没？
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2楼2014-03-22 23:27:47
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wangguosing

金虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 没有帮助楼主解答问题，不能获得应助指数 2014-03-23 10:03:37
我也是，咋办，我的是氨氧化古菌的，怎么办
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3楼2014-03-23 09:22:24
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 19:57:53
转化效率很低，可以换种转化效率高的感受态细胞试试；也有肯能连接效率太低，建议变化一下体系的量，延长连接时间
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
4楼2014-03-23 10:05:02
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-03-22 23:27:47
蓝白斑筛选了没？

没有筛啊，我们一般直接PCR筛，这次筛10个只有一个p出来
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5楼2014-03-23 14:29:31
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangguosing at 2014-03-23 09:22:24
我也是，咋办，我的是氨氧化古菌的，怎么办

不知道咋回事，这次很幸运得到一个阳性，双酶切验证也正确了，可是也不能每次都靠幸运做实验啊
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6楼2014-03-23 14:31:51
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-23 10:05:02
转化效率很低，可以换种转化效率高的感受态细胞试试；也有肯能连接效率太低，建议变化一下体系的量，延长连接时间

转化应该没问题。主要还是连接的问题，是不是T载体什么问题，有些问题没有注意让T载体自连了
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7楼2014-03-23 14:33:03
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by windleakey at 2014-03-23 14:33:03
转化应该没问题。主要还是连接的问题，是不是T载体什么问题，有些问题没有注意让T载体自连了...

可能性很大，所以要优化一下体系
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
8楼2014-03-23 17:11:47
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by tu475575025 at 2014-03-23 21:32:29
没有遇到过这种情况，连T载体效率相当高，经常会做，每次随便挑一个白斑就是阳性，后来索性不用怎么验证了。你可以从以下方面一个个排查：
1、感受态和转化方法，用完整的质粒转化试试，如果转化效率很高，说明这部 ...

谢谢建议，太认真了，打了这么多字，我会一一排查，再试试
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10楼2014-03-24 12:32:41
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