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windleakey

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[求助] PCR产物连T载体转化后，阳性率低已有3人参与

RT，最近实验发现，PCR产物经纯化后连T载体，转化后阳性率总是很低，挑10个单克隆做PCR可能只有一个是阳性的，虽然能得到想要的，但还是觉得很奇怪，不知道是什么原因。
请问有大神知道吗？

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1楼 2014-03-22 22:50:19

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tu475575025

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【答案】应助回帖

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windleakey: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-03-24 12:32:05
gyesang: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 19:58:23

没有遇到过这种情况，连T载体效率相当高，经常会做，每次随便挑一个白斑就是阳性，后来索性不用怎么验证了。你可以从以下方面一个个排查：
1、感受态和转化方法，用完整的质粒转化试试，如果转化效率很高，说明这部分没有问题。
2、确认你做pcr的酶是不是会加A，如果是的，再查下一项。
3、用T载自带的control insert 连接T截试试，如果出现效率很低，可能就是你的T截或者solution I 出问题了。
4、再要排查就要换新的T载和solution I试试了
ps：你说每次要挑10来个转化子才有一个阳性，转化子很多嘛，说明你的转化效率还是很高，只是很多是载体自连而已，这个可以用蓝白斑来排除呀。猜测是你连接时T载用量过多，插入片段量少了（如果T载正常全部是线性）。也可能是你的载体出问题了，连接前就有很多已经环化了（可以直接转1ul 没有连接的T载试试）。