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杨仔儿

木虫 (著名写手)

[求助] PMD-19-t载体连接问题,真心求助 已有18人参与

目的基因500多bp,pcr用的酶是:Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye),胶回收后连接,怎么都连接不上,求帮助。
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li201018

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:07:10
胶回收产物一定要定量,按照载体:回收产物为1:3-1:10之间都好,最好16度过夜链接,10微升连接体系。祝好运!
低调!务实!
19楼2015-06-24 11:18:25
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查看全部 47 个回答

jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
能不能说的具体点,你这样描述没法找原因啊。
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2楼2015-06-23 15:07:30
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by jiqinger at 2015-06-23 15:07:30
能不能说的具体点,你这样描述没法找原因啊。

我用的是takara公司的Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)酶p我的目的基因(500多bp),之后胶回收,浓度在70ng/ul左右,用胶回收的目的基因和pmd-18载体连接,用NEB公司的连接酶10ul体系:载体1ul,目的基因2ul,2X的buffer 5ul,DNA连接酶 0.5ul,水1.5ul,在25度温度下连接2h,做菌液PCR没有条带,提质粒跑核酸电泳,用空载体对照,结果条带显示一致,就是没连接上。我也用过takara的连接体系,过夜连接,结果都是没连接上。
3楼2015-06-23 15:44:56
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

就没有告诉一下的,
4楼2015-06-23 16:10:29
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