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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

[求助] 求助通用引物验证阳性克隆

利用PMD19-T载体，做克隆时，利用通用引物验证阳性克隆，所得M13载体是指的那一对序列啊，求解？？？

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1楼 2012-12-06 21:59:12
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★
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追梦的人1987: 金币+2, ★有帮助 2012-12-07 09:13:52
pMD19-T 可以用任意一个F引物（M13F和M13F（-47））和R引物都可以配对做PCR，其实楼主可以在载体序列上找到上述列出的四个引物，然后稍加分析一下就知道了哈
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2楼2012-12-06 22:37:09
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-06 22:37:09
pMD19-T 可以用任意一个F引物（M13F和M13F（-47））和R引物都可以配对做PCR，其实楼主可以在载体序列上找到上述列出的四个引物，然后稍加分析一下就知道了哈

可是我比对了一下，看他们的Tm值差的挺大的，没关系吗
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3楼2012-12-07 09:15:34
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
追梦的人1987: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-07 11:19:00
引用回帖:
3楼: Originally posted by 追梦的人1987 at 2012-12-07 09:15:34
可是我比对了一下，看他们的Tm值差的挺大的，没关系吗...

是没有关系的啊，以质粒为模板的PCR，可不用考虑引物Tm值
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2012-12-07 10:53:05
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
恩，谢了啊
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5楼2012-12-07 11:18:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-07 10:53:05
是没有关系的啊，以质粒为模板的PCR，可不用考虑引物Tm值...

做PCR都要考虑Tm值吧。M13引物一般是M13F, M13R；M13F(-47), M13R(-48)配对使用。如果做菌落PCR验证阳性克隆的话，如果只是把目的片段插入到多克隆位点处，这两对引物哪一对都可以的。如果是样品需要测序的话，由于接近引物的读出效果不好，如果克隆的位点接近CMS的两端，一般需要用M13F(-47), M13R(-48)来测序。
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6楼2012-12-07 13:04:59
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-07 13:04:59
做PCR都要考虑Tm值吧。M13引物一般是M13F, M13R；M13F(-47), M13R(-48)配对使用。如果做菌落PCR验证阳性克隆的话，如果只是把目的片段插入到多克隆位点处，这两对引物哪一对都可以的。如果是样品需要测序的话，由于 ...

谢了，我看了一下他们的退火温度，查的挺大的，将近十度
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7楼2012-12-07 14:42:33
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