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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

[求助] 求助通用引物验证阳性克隆

利用PMD19-T载体,做克隆时,利用通用引物验证阳性克隆,所得M13载体是指的那一对序列啊,求解???

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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
追梦的人1987: 金币+2, 有帮助 2012-12-07 09:13:52
pMD19-T 可以用任意一个F引物(M13F和M13F(-47))和R引物都可以配对做PCR,其实楼主可以在载体序列上找到上述列出的四个引物,然后稍加分析一下就知道了哈
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-12-06 22:37:09
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-06 22:37:09
pMD19-T 可以用任意一个F引物(M13F和M13F(-47))和R引物都可以配对做PCR,其实楼主可以在载体序列上找到上述列出的四个引物,然后稍加分析一下就知道了哈

可是我比对了一下,看他们的Tm值差的挺大的,没关系吗
3楼2012-12-07 09:15:34
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
追梦的人1987: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-07 11:19:00
引用回帖:
3楼: Originally posted by 追梦的人1987 at 2012-12-07 09:15:34
可是我比对了一下,看他们的Tm值差的挺大的,没关系吗...

是没有关系的啊,以质粒为模板的PCR,可不用考虑引物Tm值
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2012-12-07 10:53:05
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

恩,谢了啊
5楼2012-12-07 11:18:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-07 10:53:05
是没有关系的啊,以质粒为模板的PCR,可不用考虑引物Tm值...

做PCR都要考虑Tm值吧。M13引物一般是M13F, M13R;M13F(-47), M13R(-48)配对使用。如果做菌落PCR验证阳性克隆的话,如果只是把目的片段插入到多克隆位点处,这两对引物哪一对都可以的。如果是样品需要测序的话,由于接近引物的读出效果不好,如果克隆的位点接近CMS的两端,一般需要用M13F(-47), M13R(-48)来测序。
6楼2012-12-07 13:04:59
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-07 13:04:59
做PCR都要考虑Tm值吧。M13引物一般是M13F, M13R;M13F(-47), M13R(-48)配对使用。如果做菌落PCR验证阳性克隆的话,如果只是把目的片段插入到多克隆位点处,这两对引物哪一对都可以的。如果是样品需要测序的话,由于 ...

谢了,我看了一下他们的退火温度,查的挺大的,将近十度
7楼2012-12-07 14:42:33
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