| 查看: 4137 | 回复: 46 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
杨仔儿兑换贵宾
|
[求助]
PMD-19-t载体连接问题，真心求助 已有18人参与
|
||
| 目的基因500多bp，pcr用的酶是：Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)，胶回收后连接，怎么都连接不上，求帮助。 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有242人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有6人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
luwei13566
超级版主
- MolEPI: 3
- 应助: 184 (高中生)
- 金币: 4351.4
- 散金: 97
- 红花: 35
- 帖子: 641
- 在线: 261.1小时
- 虫号: 2380655
- 注册: 2013-03-27
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-06-23 21:58:38
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-06-23 21:58:38
|
转化后可以提质粒跑胶检测大小，那说明LZ的平板上还是长出来假阳性转化子了，平板上能有多少转化子？ T载体和连接酶都是新的还是在冰箱里放了很久的东西？ 1.如果转化子较多的话有必要做个蓝白斑筛选，筛查一下你的T载体有问题没有。以平板上深蓝色转化子作为计算自连率的标准。 2.如果转化子就那么几个，感受态做一个阳性对照，排除感受态的问题后，还是要从基因载体的浓度和比例以及连接条件上入手： 按照pmd18t的推荐体系：10ul体系：0.03pmol载体：0.1—0.3pmol基因+5ul solutionI 按照NEB的体系：20ul体系：0.02pmol载体：0.06pmol基因+10X T4 ligase buffer+1ul ligase 因此，你的基因如果真是70ng/ul的话,2ul就高达0.42pmol的浓度，基因过多反而会降低基因与载体的接触效率，其次我不知道LZ你的2Xbuffer从哪里来的，一般都是10Xbuffer，管子打开一股浓浓的DTT味道才对，连接buffer那么稀很难保证长期存放的效果。连接效率低的问题多半在此！ 至于连接条件的优化，如果遇到很难连接的体系，我一般会尝试二次连接，以Takara10ul连接体系为例，按照上述体系16度过夜连接，早上补加连接酶和连接buffer稀释到20ul，16度8h 或25度4h，下午3管并1管与感受态混合转化，转化子只多不少。 3. 如果上述筛查不解决问题的话，只能说明基因没加上A，将PCR产物加入rTaq及buffer 补加10mM dATP 72度30min加A处理！~ |
11楼2015-06-23 21:44:21
jiqinger
实习版主
- 应助: 88 (初中生)
- 金币: 5179.6
- 红花: 16
- 帖子: 745
- 在线: 165.7小时
- 虫号: 1679784
- 注册: 2012-03-10
- 性别: GG
- 专业: 化学环境污染与健康
2楼2015-06-23 15:07:30
杨仔儿
兑换贵宾
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 75.6
- 散金: 2486
- 红花: 18
- 帖子: 1616
- 在线: 290.2小时
- 虫号: 3316548
- 注册: 2014-07-10
- 性别: GG
- 专业: 原子和分子物理
3楼2015-06-23 15:44:56
杨仔儿
管理员
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 75.6
- 散金: 2486
- 红花: 18
- 帖子: 1616
- 在线: 290.2小时
- 虫号: 3316548
- 注册: 2014-07-10
- 性别: GG
- 专业: 原子和分子物理
4楼2015-06-23 16:10:29
