应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 PMD 18T载体克隆转化详细不住
101/1返回列表
查看: 3348  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

elbo

金虫 (小有名气)

[求助] 求助 PMD 18T载体克隆转化详细不住 已有1人参与

目的片段200bp左右，根据宝生物说明书上貌似做不出来，请问前辈高人给予详细的实际操作步骤，不胜感激！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-07-03 19:23:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 热心的虫子，很详细的步骤啊 2012-07-05 13:47:12
连接反应
A.        检查试剂盒内的试剂是否完整（pMD 18-T Vector、solution I和control DNA），试剂盒必须存放在-20℃。操作前应该浏览一下试剂盒提供的说明书;
B.        开启载体(pMD 18-T Vector)所在的离心管前请先离心，按照TAKARA公司提供的试剂盒说明书配置连接反应混合物(以下为一个反应的量)：
pMD 18-T Vector            0.5 µl
solution I                       2.5 µl
C.        将PCR管标记好，对应每管中加入上述回收的产物2 µl，control DNA用1 µl；
D.        分装连接反应混合液(3µl)；
E.        离心至底部，给PCR管盖上盖子（尽量不要使用矿物油）；
F.        PCR仪中16℃连接90分钟或4连接过夜（冰箱中）。

2) 转化
方法一：热激转化

A.        将所有需要使用的无菌耗材准备好；开启超净工作台；
B.        待用的移液器前端用75%的酒精消毒，放置在工作台上风干；
C.        将连接液快速离心后，取出2 µl放置于无菌1.5 ml离心管底部，置于冰盘中；
D.        从-70℃冰箱中取出感受态细胞，立即置于冰盘上。（注意：每支约100 µl，可做2个转化反应；取出后不能放回冰箱，因此须计算使用的感受态细胞支数，管中未用完的则予以丢弃）；
E.        待感受态细胞在冰盘中稍微融解后（5分钟），用无菌枪头轻柔的混匀细胞混合物。缓慢吸取50 µl感受态细胞至步骤3中的离心管中，用枪头轻轻混匀；盖严盖子后冰浴20分钟；
F.        将水浴锅调到42（温度必须准确，而且不能上下波动，建议不要使用本室水浴锅）。将离心管在水浴锅中热激90秒，注意：热激时必须保持离心管稳定，不能飘动更不能摇动。立即将离心管放回冰上冰浴2分钟；
G.        加入950 µl的室温LB（无氨苄青霉素）液体培养基至离心管中，于37℃的摇床中150 rpm培养1.5h；
H.        取出100 µl的培养物涂于37℃预热的LB固体培养基（含氨苄青霉素）表面；
I.        37℃恒温箱中过夜培养（16小时左右）。
赞一下 回复此楼
路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
7楼2012-07-05 11:02:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-04 13:44:44
给一个我们实验室常用的连接体系你吧：
pMD 18T：0.5ul
目的DNA:2.5ul
Solution I: 3ul
总计：6ul的体系
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-07-03 21:07:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by Marado at 2012-07-03 21:07:31
给一个我们实验室常用的连接体系你吧：
pMD 18T：0.5ul
目的DNA:2.5ul
Solution I: 3ul
总计：6ul的体系

实际DNA：载体的比例要根据你DNA的浓度来确定，一般是3:1~10:1的范围.
赞一下 回复此楼
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
3楼2012-07-03 21:08:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

第五平原

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-04 13:44:58
我们实验室的体系：
pMD 18T：1ul
目的DNA:4ul
Solution I: 5ul
总计：10ul的体系,16度过夜连接
赞一下 回复此楼
勤勉
4楼2012-07-03 22:03:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你给的信息太不详细了，不知道是哪一步出得问题，感受态效率过低？PCR产物没加A？都是可能的问题。
赞一下 回复此楼
相信自己
5楼2012-07-04 08:50:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

elbo

金虫 (小有名气)
需要做克隆转化的详细步骤，实验室之前的人一直没做出来，想秋一个详细攻略
赞一下 回复此楼
6楼2012-07-04 15:36:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shicaozhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们用的是宝生物的T载，只要solutionI没有问题，一般都能连得上，最好做一个蓝白斑筛选，这样效率会高一些。感受态用宝生物的试剂盒做的，效率很高，也就是冰浴30min,42℃热击90s，涂平板后如果是JM109的话9个小时就能看到蓝白斑，然后挑白的做个菌落PCR。我们连接体系一般是质粒1微升，片段2微升（pcr产物切胶回收的），水2微升，solutionI 5微升。16℃30min就好，不用过夜，所以说拿到克隆从pcr开始也就是两天的事。个人经验，仅供参考，楼主好运！
赞一下 回复此楼
8楼2012-07-05 16:40:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

elbo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 游侠892 at 2012-07-05 11:02:21
连接反应
A.        检查试剂盒内的试剂是否完整（pMD 18-T Vector、solution I和control DNA），试剂盒必须存放在-20℃。操作前应该浏览一下试剂盒提供的说明书;
B.        开启载体(pMD 18-T Vector)所在的离心管前请先离心， ...

非常感谢
回复此楼
9楼2012-07-05 17:11:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

杨仔儿

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 第五平原 at 2012-07-03 22:03:55
我们实验室的体系：
pMD 18T：1ul
目的DNA:4ul
Solution I: 5ul
总计：10ul的体系,16度过夜连接

这个体系的量和目的基因的浓度没关系吗？
赞一下 回复此楼
10楼2015-06-23 16:21:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 elbo 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭