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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转化之后复苏感受态细胞能用加了氨苄的LB培养基吗？
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] 转化之后复苏感受态细胞能用加了氨苄的LB培养基吗？ 已有3人参与

我看师姐做的是把连接产物转化到感受态细胞之后，加入800ul 不加氨苄的LB培养基，然后37℃摇菌1h。
我想问的是这一步为什么不能用加了氨苄的LB培养基呢？这样不是还可以防止杂菌的生长吗？
第一次做克隆，有些步骤的原理还不是很清楚。求高手指点！
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越努力越幸运
1楼 2013-12-13 10:59:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-13 14:44:05
柠檬可乐星: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-13 15:12:24
是不应该加的。
热激就是让菌体瞬间热胀，表面蛋白掉下来形成通道，质粒才能进去，这个过程对细菌是有伤害的。菌体42度热激之后很脆弱。另外热激时会死一部分细菌，死掉的细菌会裂解，释放出一些蛋白酶什么的，对活着的细菌也不太好。用不加抗生素的LB37度温浴是为了让还活着的细菌更好的复苏。如果加了抗生素会增加细菌复苏时的负担。但是温浴的时间也不宜过长，一般以半个小时到一个小时之间为宜。
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4楼2013-12-13 11:44:45
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根本原因是，你质粒刚转化进大肠杆菌细胞里面，那些抗性基因诸如卡那，氨苄还没有开始表达呢或者开始表达，但表达很弱，你加带抗性的LB复苏会极大的降低转化效率
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-12-13 14:43:45
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普通回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
对，严格要求下应该加，但是对自己的菌体有信息，并能够保证无菌操作，可以不加。这东西要的是结果，过程有很多条。
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我不会！
2楼2013-12-13 11:03:59
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-13 11:03:59
对，严格要求下应该加，但是对自己的菌体有信息，并能够保证无菌操作，可以不加。这东西要的是结果，过程有很多条。

我只是很奇怪，师姐做的时候是配100ml LB液体培养基，先分装50管不加氨苄的，剩下的加氨苄之后再分装。
如果全部可以用加了氨苄的为什么要这么麻烦的操作呢？又费事，又增加污染的机会，氨苄又不是啥值钱的东西。
所以我还以为是不能用加氨苄的LB来复苏感受态细胞呢，真费解。
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越努力越幸运
3楼2013-12-13 11:12:45
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2013-12-13 11:12:45
我只是很奇怪，师姐做的时候是配100ml LB液体培养基，先分装50管不加氨苄的，剩下的加氨苄之后再分装。
如果全部可以用加了氨苄的为什么要这么麻烦的操作呢？又费事，又增加污染的机会，氨苄又不是啥值钱的东西。 ...

哦……没仔细看，原以为你是都筛选完了，在培养阳性重组子呢………………如果是37度孵育，用SOC（SOB）更好一点
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我不会！
5楼2013-12-13 13:58:09
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gan19920717

铁虫 (小有名气)
这一步???是为了活化??组??，增加其数??，目的??是筛选，活化之???转移的培养基就??加入相应抗生素了，??过这一步骤在国内大家一般都???，但是国外很多文献上并无此步骤，貌似对结果影??也??大。

[ ????С??????? ]
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7楼2013-12-13 15:32:43
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gan19920717

铁虫 (小有名气)
这一步的目的是活化转化子，扩大菌量，并不是筛选，这步之后就要把其接在含有抗生素的培养基里了，不过国外这一步是不做的，国内一般都做，据说不做对结果影响并不大。
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8楼2013-12-13 22:45:53
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b6122

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-13 01:43:45
根本原因是，你质粒刚转化进大肠杆菌细胞里面，那些抗性基因诸如卡那，氨苄还没有开始表达呢或者开始表达，但表达很弱，你加带抗性的LB复苏会极大的降低转化效率

这个才是答案
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9楼2013-12-14 01:07:55
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547star

木虫 (著名写手)
没有经过无抗生素的培养直接加含抗生素的，转了质粒也会因为细胞脆弱，抗性基因没表达而死掉。一般要经过预培养和扩大培养好几个小时后才能加抗生素筛选。
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为什么
10楼2013-12-15 12:20:31
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