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ilyzp

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 急求！GFP载体转化野生型枯草芽孢杆菌以及红霉素浓度已有1人参与

因为实验室要转化野生型枯草芽孢杆菌做GFP，首先从菌种库里买了1.从土壤里分离的枯草芽孢杆菌2.从公司里买的带有GFP的可以转化枯草芽孢杆菌的载体pMUTIN-GFP+（在大肠杆菌里是氨苄抗性，在芽孢杆菌中是红霉素抗性）
因为不是做载体构建，只要把GFP空载转化进枯草芽孢杆菌就行了，刚开始先转化进了大肠杆菌，这一步很顺利，然后把提取的质粒转化枯草芽孢杆菌时出了问题。
首先是红霉素配置的问题。在网上查到红霉素是用无水乙醇溶解，储存浓度一般在50mg/ml或者100mg/ml，但是我用无水乙醇溶这个浓度根本溶解不了，无论是用搅拌子搅拌或者怎么混匀，就是溶解不了，最后只能减少浓度，试了半天最后配成1mg/ml的浓度才能勉强溶解，

但是这个浓度太低了，而我需要转化的是野生型的枯草芽孢杆菌，抗性比较强，我做过梯度，一般LB培养基需要的红霉素浓度至少是50ug/ml，这样的话我配100ML培养基就要加5ML抗生素，我怕这个会对培养基有影响。不知道一般枯草芽孢杆菌对所用红霉素的浓度是多少，而且应该怎么配置，请大家帮帮忙解答一下！
其次是转化问题。因为我前面做过梯度，用LB培养基红霉素浓度是50ug/ml时，我的原菌是不长的，所以在转化之后我也用了这个浓度，可是在转化后12h左右，平板(红霉素终浓度50ug/ml)上长满菌（现象如抗生素失效一样），全是一大片一大片的，关键是我用的感受态阴性对照没有加任何质粒的也长了满板，我又把抗生素浓度加大到100ug/ml，还是同样的情况，连阴性对照都是长了大片的菌，完全没有单菌落，全是一片一片的，可是我用同一次配的加了红霉素的培养基去划线，板上是完全不会涨的，我用的转化方法是普通的化学转化法，方法如下：
一、取对数末期的菌作为制备感受态细胞
二、转化方法：于第一天上午取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB平板，37℃培养箱培养12h。挑单菌落至3ml LB培养基中，37℃， 250 rmin培养过夜。第二天上午取160 μl培养液转接至8 ml SPI培养基中，37℃，250 rmin培养至对数生长末期 (约4~5 h)，取0.2 ml培养液至2 ml SPII培养基中，37℃，100 rmin培养90 min ，加入20ul 10mmolL EGTA，再于37℃，100 rmin培养10分钟。分装成0.5 ml每管，各加入5ul DNA，再于37℃，250rmin培养90分钟，取菌液涂布筛选平板。

试剂：
SP盐：0.2%（NH4）2SO4, 1.4%K2HPO4, 0.6%KH2PO4, 0.02%MgSO4•7H2O, 0.1%柠檬酸钠；
SPⅠ培养基：SP盐溶液加入1%体积浓度为50%葡萄糖溶液，1%体积100×CAYE溶液；
SPⅡ培养基：SPⅠ培养基加入1%体积50mmol/LCaCl2溶液，1%体积250mmol/L MgCl2溶液。

SP－A Salts Solution：（500 ml Solution）
0.4％ (NH4)2SO4 2g
2.8% K2HPO4•3H2O 14g
1.2% KH2PO4 6g
0.2% Trisodium Citrate Dihydrate 1g
121℃灭菌20min

SP－B Salts Solution：（500 ml Solution）
0.04% MgSO4•7H2O 0.2g
121℃灭菌20min

100× CAYE Solution：（100 ml Solution）
2％ Casamino acid 2g
10％ Yeast Extract 10g
121℃灭菌20min

SPI Medium：（20 mL）
9.8mL SP－A Salts Solution
9.8mL SP－B Salts Solution
200µL （1％V）Glucose（50％w/v，115℃灭菌20min）
200µL （1％V）100× CAYE

SPII Medium：（6 mL）
5.88mL SPI Medium
60µL （1％V）50mM CaCl2
60µL （1％V）250mM MgCl2

100×EGTA Solution：
10mmol／L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH至pH8.0

还有一种是

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法
1、菌种在斜面培养2天，孢子形成率接近100%。
2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢摇床（100rpm）振荡培养过夜。
3、次日取2ml转接到18ml GMⅠ中，37℃快摇床（200rpm）培养3.5小时。
4、再取10ml转接到90ml GMⅡ中，37℃慢摇床培养90分钟，离心收集菌体。
5、用10ml上清液悬浮菌体，并加30%的灭菌甘油至10%，混匀后分装到离心管中（0.5ml/Tube），随即放到-70℃保存。
6、转化时取出离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5ml菌液中加入适量DNA（1ug/ml）。
7、于37℃缓慢振荡（80rpm）保温30分钟后涂抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子。
【培养基配方】
1.10×最低盐溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4.3H2O 18.34g），KH2PO4 6g，(NH4)2SO4 2g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）1g，MgSO4.7H2O 0.2g，在蒸馏水中依次溶解，加水至100ml。
2.L- trp溶液，2mg/ml，贮于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹。
3.GMⅠ溶液：1×最低盐溶液95ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，2mg/ml L- trp 2.5ml（50ug/ml）。
4.GMⅡ溶液：1×最低盐溶液97.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.08ml，10%酵母汁0.04ml，0.5M MgCl2 0.5ml(2.5mM)，0.1M CaCl2 0.5ml(0.5mM)，2mg/ml L- trp 0.5ml（5ug/ml）。
于37℃缓慢振荡（80rpm）保温30分钟后涂抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子。

这两种方法都用过，结果是一样的，全是类似于抗生素失效的结果。还没有试过电转。请大家帮助解答一下！
急求，我已经做了很长时间了，实验停在这一步做不下去了，因为我十一回家，没法上网，中间大概有5天上不了网，所以不好悬赏金币，对不住各位，下次我一定多悬赏一些，多谢多谢

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