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elbo

金虫 (小有名气)

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[求助] 求助 PMD 18T载体克隆转化详细不住已有1人参与

目的片段200bp左右，根据宝生物说明书上貌似做不出来，请问前辈高人给予详细的实际操作步骤，不胜感激！

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1楼 2012-07-03 19:23:15

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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 热心的虫子，很详细的步骤啊 2012-07-05 13:47:12

连接反应
A. 检查试剂盒内的试剂是否完整（pMD 18-T Vector、solution I和control DNA），试剂盒必须存放在-20℃。操作前应该浏览一下试剂盒提供的说明书;
B. 开启载体(pMD 18-T Vector)所在的离心管前请先离心，按照TAKARA公司提供的试剂盒说明书配置连接反应混合物(以下为一个反应的量)：
pMD 18-T Vector 0.5 µl
solution I 2.5 µl
C. 将PCR管标记好，对应每管中加入上述回收的产物2 µl，control DNA用1 µl；
D. 分装连接反应混合液(3µl)；
E. 离心至底部，给PCR管盖上盖子（尽量不要使用矿物油）；
F. PCR仪中16℃连接90分钟或4连接过夜（冰箱中）。

2) 转化
方法一：热激转化

A. 将所有需要使用的无菌耗材准备好；开启超净工作台；
B. 待用的移液器前端用75%的酒精消毒，放置在工作台上风干；
C. 将连接液快速离心后，取出2 µl放置于无菌1.5 ml离心管底部，置于冰盘中；
D. 从-70℃冰箱中取出感受态细胞，立即置于冰盘上。（注意：每支约100 µl，可做2个转化反应；取出后不能放回冰箱，因此须计算使用的感受态细胞支数，管中未用完的则予以丢弃）；
E. 待感受态细胞在冰盘中稍微融解后（5分钟），用无菌枪头轻柔的混匀细胞混合物。缓慢吸取50 µl感受态细胞至步骤3中的离心管中，用枪头轻轻混匀；盖严盖子后冰浴20分钟；
F. 将水浴锅调到42（温度必须准确，而且不能上下波动，建议不要使用本室水浴锅）。将离心管在水浴锅中热激90秒，注意：热激时必须保持离心管稳定，不能飘动更不能摇动。立即将离心管放回冰上冰浴2分钟；
G. 加入950 µl的室温LB（无氨苄青霉素）液体培养基至离心管中，于37℃的摇床中150 rpm培养1.5h；
H. 取出100 µl的培养物涂于37℃预热的LB固体培养基（含氨苄青霉素）表面；
I. 37℃恒温箱中过夜培养（16小时左右）。