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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PMD-19-t载体连接问题，真心求助
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-06-23 21:58:38
转化后可以提质粒跑胶检测大小，那说明LZ的平板上还是长出来假阳性转化子了，平板上能有多少转化子？ T载体和连接酶都是新的还是在冰箱里放了很久的东西？
1.如果转化子较多的话有必要做个蓝白斑筛选，筛查一下你的T载体有问题没有。以平板上深蓝色转化子作为计算自连率的标准。
2.如果转化子就那么几个，感受态做一个阳性对照，排除感受态的问题后，还是要从基因载体的浓度和比例以及连接条件上入手：
按照pmd18t的推荐体系：10ul体系：0.03pmol载体：0.1—0.3pmol基因+5ul solutionI  
按照NEB的体系：20ul体系：0.02pmol载体：0.06pmol基因+10X T4 ligase buffer+1ul ligase
因此，你的基因如果真是70ng/ul的话,2ul就高达0.42pmol的浓度，基因过多反而会降低基因与载体的接触效率，其次我不知道LZ你的2Xbuffer从哪里来的，一般都是10Xbuffer，管子打开一股浓浓的DTT味道才对，连接buffer那么稀很难保证长期存放的效果。连接效率低的问题多半在此！
      至于连接条件的优化，如果遇到很难连接的体系，我一般会尝试二次连接，以Takara10ul连接体系为例，按照上述体系16度过夜连接，早上补加连接酶和连接buffer稀释到20ul，16度8h 或25度4h，下午3管并1管与感受态混合转化，转化子只多不少。
3. 如果上述筛查不解决问题的话，只能说明基因没加上A，将PCR产物加入rTaq及buffer 补加10mM dATP 72度30min加A处理！~
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大家相互帮助哈
11楼2015-06-23 21:44:21
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ASHzoulan

禁虫 (小有名气)
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本帖内容被屏蔽
12楼2015-06-23 22:02:34
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
怎么可能，，，买一个快速连接试剂盒吧

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13楼2015-06-23 22:14:50
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

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连接时间不是问题，因为基因不大，体系也不是大问题，因为是做TA克隆…可以这样再试试…
1回收产物要加a
2换用新的T载体
3连接体系在加等量的solution1之前可以50度   5分钟，后冰上五分钟…
4尝试PCR产物直接回收，不切胶…
5菌液PCR检测用载体通用引物更稳定…提取质粒也不便直接跑较检测，而要用酶切检测的方法…祝好运…

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
14楼2015-06-23 22:23:48
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
难道a尾没连上去？我也不太懂，感觉步骤没错啊，我22度连接一小时，20ul体系，你可以一次多连几管试试
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15楼2015-06-23 23:33:47
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397608492

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-06-23 15:44:56
我用的是takara公司的Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)酶p我的目的基因（500多bp），之后胶回收，浓度在70ng/ul左右，用胶回收的目的基因和pmd-18载体连接，用NEB公司的连接酶10ul体系：载体1ul，目的 ...

NEB的T4试试16摄氏度保温7h

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16楼2015-06-24 00:35:34
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sundan611

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:07:41
回收模板浓度没问题的话，你就用宝生物的与PMD18T配套的buffer和连接酶，不用NEB的，
载体1ul 目的片段4ul 水5ul 16度连接过夜 连接做一个阳性对照 PMD18T试剂盒里有一个阳性对照
确定感受态没有问题
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17楼2015-06-24 08:53:51
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你确定切开了吗？回收的片段和载体酶切片段确定正确吗？
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努力打败一切
18楼2015-06-24 10:51:18
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li201018

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:07:10
胶回收产物一定要定量，按照载体：回收产物为1:3-1:10之间都好，最好16度过夜链接，10微升连接体系。祝好运！
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低调！务实！
19楼2015-06-24 11:18:25
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:06:18
你可以尝试一下用16℃连接，过夜效果应该好一点。我以前成功连接过5000bp片段。实在连接不上，你就直接送PCR产物测序吧，和18t测序没有多大的区别。
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20楼2015-06-25 21:35:22
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