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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励回帖交流 2015-06-23 21:58:38
转化后可以提质粒跑胶检测大小,那说明LZ的平板上还是长出来假阳性转化子了,平板上能有多少转化子? T载体和连接酶都是新的还是在冰箱里放了很久的东西?
1.如果转化子较多的话有必要做个蓝白斑筛选,筛查一下你的T载体有问题没有。以平板上深蓝色转化子作为计算自连率的标准。
2.如果转化子就那么几个,感受态做一个阳性对照,排除感受态的问题后,还是要从基因载体的浓度和比例以及连接条件上入手:
按照pmd18t的推荐体系:10ul体系:0.03pmol载体:0.1—0.3pmol基因+5ul solutionI  
按照NEB的体系:20ul体系:0.02pmol载体:0.06pmol基因+10X T4 ligase buffer+1ul ligase
因此,你的基因如果真是70ng/ul的话,2ul就高达0.42pmol的浓度,基因过多反而会降低基因与载体的接触效率,其次我不知道LZ你的2Xbuffer从哪里来的,一般都是10Xbuffer,管子打开一股浓浓的DTT味道才对,连接buffer那么稀很难保证长期存放的效果。连接效率低的问题多半在此!
      至于连接条件的优化,如果遇到很难连接的体系,我一般会尝试二次连接,以Takara10ul连接体系为例,按照上述体系16度过夜连接,早上补加连接酶和连接buffer稀释到20ul,16度8h 或25度4h,下午3管并1管与感受态混合转化,转化子只多不少。
3. 如果上述筛查不解决问题的话,只能说明基因没加上A,将PCR产物加入rTaq及buffer 补加10mM dATP 72度30min加A处理!~
大家相互帮助哈
11楼2015-06-23 21:44:21
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ASHzoulan

禁虫 (小有名气)

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12楼2015-06-23 22:02:34
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

怎么可能,,,买一个快速连接试剂盒吧

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13楼2015-06-23 22:14:50
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

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连接时间不是问题,因为基因不大,体系也不是大问题,因为是做TA克隆…可以这样再试试…
1回收产物要加a
2换用新的T载体
3连接体系在加等量的solution1之前可以50度   5分钟,后冰上五分钟…
4尝试PCR产物直接回收,不切胶…
5菌液PCR检测用载体通用引物更稳定…提取质粒也不便直接跑较检测,而要用酶切检测的方法…祝好运…

[ 发自小木虫客户端 ]
特别喜欢家门口开门的瞬间,宝宝那个高兴呀,蹦蹦跳跳,好不热闹!
14楼2015-06-23 22:23:48
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)

难道a尾没连上去?我也不太懂,感觉步骤没错啊,我22度连接一小时,20ul体系,你可以一次多连几管试试
15楼2015-06-23 23:33:47
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397608492

新虫 (小有名气)

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引用回帖:
3楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-06-23 15:44:56
我用的是takara公司的Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)酶p我的目的基因(500多bp),之后胶回收,浓度在70ng/ul左右,用胶回收的目的基因和pmd-18载体连接,用NEB公司的连接酶10ul体系:载体1ul,目的 ...

NEB的T4试试16摄氏度保温7h

[ 发自小木虫客户端 ]
16楼2015-06-24 00:35:34
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sundan611

铁虫 (小有名气)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:07:41
回收模板浓度没问题的话,你就用宝生物的与PMD18T配套的buffer和连接酶,不用NEB的,
载体1ul 目的片段4ul 水5ul 16度连接过夜 连接做一个阳性对照 PMD18T试剂盒里有一个阳性对照
确定感受态没有问题
17楼2015-06-24 08:53:51
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

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你确定切开了吗?回收的片段和载体酶切片段确定正确吗?
努力打败一切
18楼2015-06-24 10:51:18
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li201018

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖


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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:07:10
胶回收产物一定要定量,按照载体:回收产物为1:3-1:10之间都好,最好16度过夜链接,10微升连接体系。祝好运!
低调!务实!
19楼2015-06-24 11:18:25
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:06:18
你可以尝试一下用16℃连接,过夜效果应该好一点。我以前成功连接过5000bp片段。实在连接不上,你就直接送PCR产物测序吧,和18t测序没有多大的区别。
20楼2015-06-25 21:35:22
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