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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 空质粒做PCR也能P出目的条带
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雪中花sml

新虫 (小有名气)

[求助] 空质粒做PCR也能P出目的条带 已有6人参与

最近构建质粒，在筛选的过程中发现空质粒作模板也能P出我的目的基因条带，无法有效筛选重组的质粒，求大神帮忙解决这种问题
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向着前方迈进
1楼 2015-05-29 19:48:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-01 22:53:04
有两种可能：第一你不能肯定P出来的就是你的目的条带把，只是大小差不多（应该没测序验证）可能是载体上的错配，再就是你的pcr产物没连进去，但是在转化的过程中还是和菌混在一起了，也有这种可能P出来，以前也经常遇到P出来有条带，但是测序是空载的情况，暂时只能这么解释。如果有大神有更好的解释，请告知
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2楼2015-05-29 22:45:34
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雪中花sml

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a13515517892 at 2015-05-29 22:45:34
有两种可能：第一你不能肯定P出来的就是你的目的条带把，只是大小差不多（应该没测序验证）可能是载体上的错配，再就是你的pcr产物没连进去，但是在转化的过程中还是和菌混在一起了，也有这种可能P出来，以前也经常 ...

我是每次做菌落PCR和提质粒都能P出来，双酶切就切不开，测序也是空载体
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向着前方迈进
5楼2015-05-30 12:56:56
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LuM_QD

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-01 22:54:21
你做连接的产物里有你的insert，你转化后铺在平板上，你的insert DNA也在平板上，注意哦，大部分的insert没有连上载体里，就这么铺在平板表面，你养了一晚上，这些DNA也没有被降解，所以 很容易pcr出来。建议用载体上的引物试一下，效果会很准确

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呵呵
10楼2015-05-30 14:01:21
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普通回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-01 22:54:54
LZ你PCR体系污染的可能性是不小的
1.你最初是想用空载质粒做阴性对照，转化子的筛选是用菌落PCR来做的吧，若以已经提好的空质粒为模板能扩出来与你基因大小相同的序列，若带型清晰的话，污染的可能性非常的大。
2.建议用你补齐PCR体系中所用的dd水做模板做一个阴性对照筛查一下PCR体系是否有污染。
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3楼2015-05-30 00:22:12
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小手铐

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-01 22:55:14
我也遇到这种情况，做菌液PCR的时候P不出条带（同时做了阳性对照和阴性对照，阳性的扩出来，阴性的P不出来），然后把P不出来的菌液提质粒，做质粒PCR，可以P出来（也做了阳性和阴性对照，阳性扩出，阴性P不出），最后把质粒送去测序，测序结果是空载。郁闷死了。
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4楼2015-05-30 09:09:53
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雪中花sml

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-30 00:22:12
LZ你PCR体系污染的可能性是不小的
1.你最初是想用空载质粒做阴性对照，转化子的筛选是用菌落PCR来做的吧，若以已经提好的空质粒为模板能扩出来与你基因大小相同的序列，若带型清晰的话，污染的可能性非常的大。
2 ...

P出来的条带还是很清楚的，每次做菌落PCR和提质粒都能P出来，难道是每次都污染了吗？第二个建议是不加模板去P吗
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向着前方迈进
6楼2015-05-30 12:59:01
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a13515517892

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币-5, 禁止发布带有商业性质的回帖 2015-06-01 22:56:07
西门吹雪170: 应助指数-1, 屏蔽内容, 禁止发布带有商业性质的回帖 2015-06-01 22:56:30
本帖内容被屏蔽
7楼2015-05-30 13:12:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 雪中花sml at 2015-05-30 12:59:01
P出来的条带还是很清楚的，每次做菌落PCR和提质粒都能P出来，难道是每次都污染了吗？第二个建议是不加模板去P吗...

1.你说每次都能扩出来，那有没有扩不出来的情况呢，还是只要做菌落PCR都能扩出点东西？如果是PCR buffer，Q水一类的污染了的话，那确实每一次都能扩出条带。
2.对，不加模板扩一下看看。
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大家相互帮助哈
8楼2015-05-30 13:28:10
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LuM_QD

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
呵呵，你是做的菌落pcr吗？让大神告诉你为什么吧

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呵呵
9楼2015-05-30 13:55:35
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