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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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雪中花sml

新虫 (小有名气)

[求助] 空质粒做PCR也能P出目的条带 已有6人参与

最近构建质粒,在筛选的过程中发现空质粒作模板也能P出我的目的基因条带,无法有效筛选重组的质粒,求大神帮忙解决这种问题
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-01 22:53:04
有两种可能:第一你不能肯定P出来的就是你的目的条带把,只是大小差不多(应该没测序验证)可能是载体上的错配,再就是你的pcr产物没连进去,但是在转化的过程中还是和菌混在一起了,也有这种可能P出来,以前也经常遇到P出来有条带,但是测序是空载的情况,暂时只能这么解释。如果有大神有更好的解释,请告知
2楼2015-05-29 22:45:34
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雪中花sml

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by a13515517892 at 2015-05-29 22:45:34
有两种可能:第一你不能肯定P出来的就是你的目的条带把,只是大小差不多(应该没测序验证)可能是载体上的错配,再就是你的pcr产物没连进去,但是在转化的过程中还是和菌混在一起了,也有这种可能P出来,以前也经常 ...

我是每次做菌落PCR和提质粒都能P出来,双酶切就切不开,测序也是空载体
向着前方迈进
5楼2015-05-30 12:56:56
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LuM_QD

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-01 22:54:21
你做连接的产物里有你的insert,你转化后铺在平板上,你的insert DNA也在平板上,注意哦,大部分的insert没有连上载体里,就这么铺在平板表面,你养了一晚上,这些DNA也没有被降解,所以 很容易pcr出来。建议用载体上的引物试一下,效果会很准确

[ 发自小木虫客户端 ]
呵呵
10楼2015-05-30 14:01:21
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普通回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-06-01 22:54:54
LZ你PCR体系污染的可能性是不小的
1.你最初是想用空载质粒做阴性对照,转化子的筛选是用菌落PCR来做的吧,若以已经提好的空质粒为模板能扩出来与你基因大小相同的序列,若带型清晰的话,污染的可能性非常的大。
2.建议用你补齐PCR体系中所用的dd水做模板做一个阴性对照筛查一下PCR体系是否有污染。
大家相互帮助哈
3楼2015-05-30 00:22:12
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小手铐

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-01 22:55:14
我也遇到这种情况,做菌液PCR的时候P不出条带(同时做了阳性对照和阴性对照,阳性的扩出来,阴性的P不出来),然后把P不出来的菌液提质粒,做质粒PCR,可以P出来(也做了阳性和阴性对照,阳性扩出,阴性P不出),最后把质粒送去测序,测序结果是空载。郁闷死了。
4楼2015-05-30 09:09:53
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雪中花sml

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-30 00:22:12
LZ你PCR体系污染的可能性是不小的
1.你最初是想用空载质粒做阴性对照,转化子的筛选是用菌落PCR来做的吧,若以已经提好的空质粒为模板能扩出来与你基因大小相同的序列,若带型清晰的话,污染的可能性非常的大。
2 ...

P出来的条带还是很清楚的,每次做菌落PCR和提质粒都能P出来,难道是每次都污染了吗?第二个建议是不加模板去P吗
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6楼2015-05-30 12:59:01
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a13515517892

木虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币-5, 禁止发布带有商业性质的回帖 2015-06-01 22:56:07
西门吹雪170: 应助指数-1, 屏蔽内容, 禁止发布带有商业性质的回帖 2015-06-01 22:56:30
本帖内容被屏蔽

7楼2015-05-30 13:12:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 雪中花sml at 2015-05-30 12:59:01
P出来的条带还是很清楚的,每次做菌落PCR和提质粒都能P出来,难道是每次都污染了吗?第二个建议是不加模板去P吗...

1.你说每次都能扩出来,那有没有扩不出来的情况呢,还是只要做菌落PCR都能扩出点东西?如果是PCR buffer,Q水一类的污染了的话,那确实每一次都能扩出条带。
2.对,不加模板扩一下看看。
大家相互帮助哈
8楼2015-05-30 13:28:10
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LuM_QD

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
呵呵,你是做的菌落pcr吗?让大神告诉你为什么吧

[ 发自小木虫客户端 ]
呵呵
9楼2015-05-30 13:55:35
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