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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌落PCR明显有目标条带，酶切验证却不对，测序也没结果
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weilan-Joden

新虫 (初入文坛)

[交流] 菌落PCR明显有目标条带，酶切验证却不对，测序也没结果 已有6人参与

质粒双酶切，割胶回收，感觉还是有杂带，没有进I啊哦带一步纯化直接酶连，大肠长出来之后做菌落PCR，有一株菌有明显条带，但是提取质粒进行双酶切验证却没有切成功，用引物对质粒进行PCR，有两条非常明显的条带，这是为什么？
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1楼 2014-10-17 18:50:58
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)
菌落pcr经常有非特异性带

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2楼2014-10-17 22:16:23
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cnzpli

金虫 (正式写手)
★
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我的pcr酶切都对就是测序不对

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3楼2014-10-18 09:08:27
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593318518

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得就是你的酶切位点突变了。测序就知道了
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4楼2014-10-18 10:36:05
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-22 12:26:46
PCR存在假阳性，应该以酶切结果为准！有时候个别克隆酶切位点会有突变，这也是不能用的！质粒作为模板P的效果相对特异些，但不敢保证完全正确，有时候引物非特异扩增会显示载体序列！建议再挑克隆，pcr检测后再酶切检测！

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
5楼2014-10-18 12:51:16
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xiongxiong5900

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-10-22 12:26:50
菌落直接PCR会有假阳性。想避免假阳性出现又想通过PCR的方法鉴定的话，可以将单克隆挑起，摇成菌液，之后用菌液做模板进行PCR。再看看能不能扩出来。
如果能扩出特异条带，再菌液提取质粒，质粒再酶切鉴定，如果酶切条带也对的话，再送测序。
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6楼2014-10-21 16:00:45
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alian1111

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
假阳性，我们也遇到过
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7楼2015-05-30 16:18:52
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