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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。
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juan_819

铁虫 (初入文坛)

[求助] 本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。 已有4人参与

我已经设计了两对引物。第一对做的不太成功。第二对今天早上做了一下可以扩出来一些。在1500bp附近有我需要的目的基因，但是我用早上的产物做二次扩增的时候却怎么也做不出来了。只有引物二聚体。想问一下，如果改用LAtaq酶会不会效果好一些，在引物、镁离子等浓度上有什么需要注意的地方，希望各位指点一下，谢谢。

本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。
上午做梯度的结果


本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。-1
用第四第五管做二次pcr的结果
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1楼 2015-04-15 16:44:41
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Sunshine092

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-15 22:06:12
有引物二聚体可以尝试提高一下退火温度，目的条带暗可以增加循环数，至于说用pcr产物做模板继续pcr一般是需要稀释产物之后再做二次pcr。
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2楼2015-04-15 16:54:05
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wjasaa

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-15 22:06:29
两次都是引物加太多了，一轮PCR出来目的片段就很少，大部分都是二聚体，用这个做模板没有条带也正常。
建议一轮PCR重做，减少引物量。
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3楼2015-04-15 16:56:39
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 16:54:05
有引物二聚体可以尝试提高一下退火温度，目的条带暗可以增加循环数，至于说用pcr产物做模板继续pcr一般是需要稀释产物之后再做二次pcr。

我已经用40个循环了，还可以在继续加么
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4楼2015-04-15 17:08:57
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by wjasaa at 2015-04-15 16:56:39
两次都是引物加太多了，一轮PCR出来目的片段就很少，大部分都是二聚体，用这个做模板没有条带也正常。
建议一轮PCR重做，减少引物量。

我现在用的体系是50μl
ddH2O27.75μl
Buffer    5μl
Mg2+    4μl
dNTP    4μl
引物F    2μl
      R    2μl
rTaq     0.25μl
DNA5μl
请问哪里需要改进的谢谢啦
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5楼2015-04-15 17:15:45
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Sunshine092

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 17:08:57
我已经用40个循环了，还可以在继续加么...

增加第一轮PCR用的模板量或减低模板的稀释倍数。要做第二轮PCR之前可以用PCR产物纯化试剂盒纯化一下第一轮的PCR产物来去掉引物二聚体后再稀释来作为模板。
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6楼2015-04-15 17:51:55
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Sunshine092

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 17:15:45
我现在用的体系是50μl
ddH2O27.75μl
Buffer    5μl
Mg2+    4μl
dNTP    4μl
引物F    2μl
      R    2μl
rTaq     0.25μl
DNA5μl
请问哪里需要改进的谢谢啦...

我用的体系是50μl
ddH2O 36.5μl
Buffer（Mg2+ plus）    5μl
dNTP (2.5mmol/L)   4μl
引物F(10μmol/L)    1μl
      R    1μl
rTaq (5U/μl)      0.5μl
cDNA     2μl
我用的Buffer里有镁离子 cDNA一般用的是提的RNA反转稀释10倍后作为模板
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7楼2015-04-15 18:00:57
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 17:51:55
增加第一轮PCR用的模板量或减低模板的稀释倍数。要做第二轮PCR之前可以用PCR产物纯化试剂盒纯化一下第一轮的PCR产物来去掉引物二聚体后再稀释来作为模板。...

我们实验室目前还没有做过pcr产物回收 请问你所说的PCR产物纯化试剂盒是胶回收 还是直接拿pcr产物就可以做了
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8楼2015-04-15 18:58:46
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 18:00:57
我用的体系是50μl
ddH2O 36.5μl
Buffer（Mg2+ plus）    5μl
dNTP (2.5mmol/L)   4μl
引物F(10μmol/L)    1μl
      R    1μl
rTaq (5U/μl)      0.5μl
cDNA     2μl
我用的Buffer里有镁离子 cD ...

稀释的话 是用双蒸水吗  我用的是师姐之前做ITS2的条件 所以很多地方还需要在摸索一下。我再改改吧 LAtaq可以用么
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9楼2015-04-15 19:00:25
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Sunshine092

木虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 18:58:46
我们实验室目前还没有做过pcr产物回收 请问你所说的PCR产物纯化试剂盒是胶回收 还是直接拿pcr产物就可以做了...

实验室用的是生工的PCR产物纯化试剂盒，因为引物二聚体片段很小所以可以去掉，直接用PCR产物就行。
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10楼2015-04-15 19:42:51
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