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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。
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Sunshine092

木虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-15 22:07:01
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9楼: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 19:00:25
稀释的话 是用双蒸水吗  我用的是师姐之前做ITS2的条件 所以很多地方还需要在摸索一下。我再改改吧 LAtaq可以用么...

cDNA稀释用的是灭了菌的双蒸水。 LAtaq可以啊。LAtaq的保真性比rTaq好，我们一般用来做构建，P长片段的时候也用LAtaq。
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11楼2015-04-15 19:45:25
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 19:42:51
实验室用的是生工的PCR产物纯化试剂盒，因为引物二聚体片段很小所以可以去掉，直接用PCR产物就行。...

200bp左右的引物二聚体都可以去掉么 可不可以把你们实验室所用的货号告诉我一下。谢谢
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12楼2015-04-15 20:25:00
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

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目前用的是什么酶？ 不建议使用LA Taq酶，因为它专门针对长片段（起码也得8kb以上），你现在是1500bp不算长片段，扩增效果可能会适得其反，（当然成功也有可能，毕竟是分子实验看不见摸不着的）
建议可以尝试降落PCR，摸索一下退火温度或优化反应组分，使用特异性较好的酶
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
13楼2015-04-16 08:57:30
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Sunshine092

木虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 20:25:00
200bp左右的引物二聚体都可以去掉么 可不可以把你们实验室所用的货号告诉我一下。谢谢...

200bp的引物二聚体。。。200bp应该不能
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14楼2015-04-16 12:18:23
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)

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感谢参与，应助指数 +1
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13楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-04-16 08:57:30
目前用的是什么酶？ 不建议使用LA Taq酶，因为它专门针对长片段（起码也得8kb以上），你现在是1500bp不算长片段，扩增效果可能会适得其反，（当然成功也有可能，毕竟是分子实验看不见摸不着的）
建议可以尝试降落P ...

现在用的是rtaq酶。我做过梯度了，50-60之间。因为设计引物的时候，两个都在60度左右。第一张图就是我做梯度的结果。就是扩出来的目的片段很淡，我不知道怎么优化条件

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15楼2015-04-16 12:44:31
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18761615793

木虫 (正式写手)

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15楼: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-16 12:44:31
现在用的是rtaq酶。我做过梯度了，50-60之间。因为设计引物的时候，两个都在60度左右。第一张图就是我做梯度的结果。就是扩出来的目的片段很淡，我不知道怎么优化条件
...

扩增出来的条带很淡，说明是扩增出来了，只是条件不是最佳的所以条带较淡，优化就是加入不同的镁离子浓度对比结果，也可适当的添加DMSO有助于扩增，或者使用高特异性的热启动聚合酶，就是这样优化，做实验嘛，最重要的就是摸索，其他也没啥的，还有就是不要把事情想的太复杂
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
16楼2015-04-16 14:02:23
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慕辰sherry

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16楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-04-16 14:02:23
扩增出来的条带很淡，说明是扩增出来了，只是条件不是最佳的所以条带较淡，优化就是加入不同的镁离子浓度对比结果，也可适当的添加DMSO有助于扩增，或者使用高特异性的热启动聚合酶，就是这样优化，做实验嘛，最重 ...

好的。谢谢。我先摸索一下。有疑惑再上来请教(￣∇￣)

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17楼2015-04-16 17:29:41
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