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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。
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juan_819

铁虫 (初入文坛)

[求助] 本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。 已有4人参与

我已经设计了两对引物。第一对做的不太成功。第二对今天早上做了一下可以扩出来一些。在1500bp附近有我需要的目的基因，但是我用早上的产物做二次扩增的时候却怎么也做不出来了。只有引物二聚体。想问一下，如果改用LAtaq酶会不会效果好一些，在引物、镁离子等浓度上有什么需要注意的地方，希望各位指点一下，谢谢。

本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。
上午做梯度的结果


本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。-1
用第四第五管做二次pcr的结果
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1楼 2015-04-15 16:44:41
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-16 12:44:31
现在用的是rtaq酶。我做过梯度了，50-60之间。因为设计引物的时候，两个都在60度左右。第一张图就是我做梯度的结果。就是扩出来的目的片段很淡，我不知道怎么优化条件
...

扩增出来的条带很淡，说明是扩增出来了，只是条件不是最佳的所以条带较淡，优化就是加入不同的镁离子浓度对比结果，也可适当的添加DMSO有助于扩增，或者使用高特异性的热启动聚合酶，就是这样优化，做实验嘛，最重要的就是摸索，其他也没啥的，还有就是不要把事情想的太复杂
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
16楼2015-04-16 14:02:23
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Sunshine092

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-15 22:06:12
有引物二聚体可以尝试提高一下退火温度，目的条带暗可以增加循环数，至于说用pcr产物做模板继续pcr一般是需要稀释产物之后再做二次pcr。
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2楼2015-04-15 16:54:05
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wjasaa

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-15 22:06:29
两次都是引物加太多了，一轮PCR出来目的片段就很少，大部分都是二聚体，用这个做模板没有条带也正常。
建议一轮PCR重做，减少引物量。
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3楼2015-04-15 16:56:39
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慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 16:54:05
有引物二聚体可以尝试提高一下退火温度，目的条带暗可以增加循环数，至于说用pcr产物做模板继续pcr一般是需要稀释产物之后再做二次pcr。

我已经用40个循环了，还可以在继续加么
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4楼2015-04-15 17:08:57
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