应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。
171/2返回列表12下一页
查看: 1661  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

juan_819

铁虫 (初入文坛)

[求助] 本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。 已有4人参与

我已经设计了两对引物。第一对做的不太成功。第二对今天早上做了一下可以扩出来一些。在1500bp附近有我需要的目的基因，但是我用早上的产物做二次扩增的时候却怎么也做不出来了。只有引物二聚体。想问一下，如果改用LAtaq酶会不会效果好一些，在引物、镁离子等浓度上有什么需要注意的地方，希望各位指点一下，谢谢。

本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。
上午做梯度的结果


本人分子生物小白一枚，刚刚开始做pcr，目前在扩cDNA的全长 。。。-1
用第四第五管做二次pcr的结果
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-04-15 16:44:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Sunshine092

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-15 22:06:12
有引物二聚体可以尝试提高一下退火温度，目的条带暗可以增加循环数，至于说用pcr产物做模板继续pcr一般是需要稀释产物之后再做二次pcr。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2015-04-15 16:54:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

wjasaa

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-15 22:06:29
两次都是引物加太多了，一轮PCR出来目的片段就很少，大部分都是二聚体，用这个做模板没有条带也正常。
建议一轮PCR重做，减少引物量。
赞一下 回复此楼
WWW.ABMGOOD.COM
3楼2015-04-15 16:56:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 16:54:05
有引物二聚体可以尝试提高一下退火温度，目的条带暗可以增加循环数，至于说用pcr产物做模板继续pcr一般是需要稀释产物之后再做二次pcr。

我已经用40个循环了，还可以在继续加么
赞一下 回复此楼
4楼2015-04-15 17:08:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wjasaa at 2015-04-15 16:56:39
两次都是引物加太多了，一轮PCR出来目的片段就很少，大部分都是二聚体，用这个做模板没有条带也正常。
建议一轮PCR重做，减少引物量。

我现在用的体系是50μl
ddH2O27.75μl
Buffer    5μl
Mg2+    4μl
dNTP    4μl
引物F    2μl
      R    2μl
rTaq     0.25μl
DNA5μl
请问哪里需要改进的谢谢啦
赞一下 回复此楼
5楼2015-04-15 17:15:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Sunshine092

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 17:08:57
我已经用40个循环了，还可以在继续加么...

增加第一轮PCR用的模板量或减低模板的稀释倍数。要做第二轮PCR之前可以用PCR产物纯化试剂盒纯化一下第一轮的PCR产物来去掉引物二聚体后再稀释来作为模板。
赞一下 回复此楼
6楼2015-04-15 17:51:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Sunshine092

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 17:15:45
我现在用的体系是50μl
ddH2O27.75μl
Buffer    5μl
Mg2+    4μl
dNTP    4μl
引物F    2μl
      R    2μl
rTaq     0.25μl
DNA5μl
请问哪里需要改进的谢谢啦...

我用的体系是50μl
ddH2O 36.5μl
Buffer（Mg2+ plus）    5μl
dNTP (2.5mmol/L)   4μl
引物F(10μmol/L)    1μl
      R    1μl
rTaq (5U/μl)      0.5μl
cDNA     2μl
我用的Buffer里有镁离子 cDNA一般用的是提的RNA反转稀释10倍后作为模板
赞一下 回复此楼
7楼2015-04-15 18:00:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 17:51:55
增加第一轮PCR用的模板量或减低模板的稀释倍数。要做第二轮PCR之前可以用PCR产物纯化试剂盒纯化一下第一轮的PCR产物来去掉引物二聚体后再稀释来作为模板。...

我们实验室目前还没有做过pcr产物回收 请问你所说的PCR产物纯化试剂盒是胶回收 还是直接拿pcr产物就可以做了
赞一下 回复此楼
8楼2015-04-15 18:58:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

慕辰sherry

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Sunshine092 at 2015-04-15 18:00:57
我用的体系是50μl
ddH2O 36.5μl
Buffer（Mg2+ plus）    5μl
dNTP (2.5mmol/L)   4μl
引物F(10μmol/L)    1μl
      R    1μl
rTaq (5U/μl)      0.5μl
cDNA     2μl
我用的Buffer里有镁离子 cD ...

稀释的话 是用双蒸水吗  我用的是师姐之前做ITS2的条件 所以很多地方还需要在摸索一下。我再改改吧 LAtaq可以用么
赞一下 回复此楼
9楼2015-04-15 19:00:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Sunshine092

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 慕辰sherry at 2015-04-15 18:58:46
我们实验室目前还没有做过pcr产物回收 请问你所说的PCR产物纯化试剂盒是胶回收 还是直接拿pcr产物就可以做了...

实验室用的是生工的PCR产物纯化试剂盒，因为引物二聚体片段很小所以可以去掉，直接用PCR产物就行。
赞一下 回复此楼
10楼2015-04-15 19:42:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 juan_819 的主题更新
171/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0805 316求调剂 +6 大雪深藏 2026-03-18 6/300 2026-03-24 22:13 by peike
[考研] 070300化学求调剂 +9 苑豆豆 2026-03-20 9/450 2026-03-24 17:15 by licg0208
[考研] 材料考研调剂生 +3 黄粱一梦千年 2026-03-24 3/150 2026-03-24 17:00 by barlinike
[考研] 277分求调剂，跨调材料 +3 考研调剂lxh 2026-03-24 3/150 2026-03-24 13:52 by JourneyLucky
[考研] 305分求调剂（食品工程） +5 Sxy112 2026-03-21 7/350 2026-03-24 12:27 by 544594351
[论文投稿] 急发核心期刊论文 +3 贤达问津 2026-03-23 5/250 2026-03-23 17:13 by 妹子不好惹
[考研] 333求调剂 +6 87639 2026-03-21 10/500 2026-03-23 10:41 by Iveryant
[考研] 291求调剂 +5 孅華 2026-03-22 5/250 2026-03-23 09:20 by haoshis
[考研] 293求调剂 +3 涛涛Wjt 2026-03-22 5/250 2026-03-22 22:21 by jiangpengfei
[考研] 289求调剂 +7 怀瑾握瑜l 2026-03-20 7/350 2026-03-22 15:57 by ColorlessPI
[考研] 303求调剂 +5 安忆灵 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:46 by 素颜倾城1988
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:09 by 星空星月
[考研] 085600材料与化工306 +4 z1z2z3879 2026-03-21 4/200 2026-03-21 23:44 by ms629
[考研] 265求调剂 +12 梁梁校校 2026-03-19 14/700 2026-03-21 13:38 by lature00
[考研] 22 350 本科985求调剂，求老登收留 +3 李轶男003 2026-03-20 3/150 2026-03-21 13:28 by 搏击518
[考研] 南京大学化学376求调剂 +3 hisfailed 2026-03-19 6/300 2026-03-20 23:43 by hisfailed
[考研] 288求调剂 +16 于海海海海 2026-03-19 16/800 2026-03-20 22:28 by JourneyLucky
[考研] 求调剂一志愿南京航空航天大学289分 +3 @taotao 2026-03-19 3/150 2026-03-20 21:34 by JourneyLucky
[考研] 一志愿南理工085701环境302求调剂院校 +3 葵梓卫队 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:28 by zhukairuo
[考研] 本科郑州大学物理学院，一志愿华科070200学硕，346求调剂 +4 我不是一根葱 2026-03-18 4/200 2026-03-19 09:11 by 浮云166
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭