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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助PCR扩增不出来的问题.....
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芕星悦

新虫 (小有名气)

[求助] 求助PCR扩增不出来的问题.....已有11人参与

最近做分子实验PCR，总是做不出来，不知道哪位大侠能够指点一下....

PCR反应总体系为20 ul，其中包含：
DNA（10 ng/ul） 3ul ；
Primers（2 uM）上下游各3ul；
Taq酶（5U/ul） 0.2ul；
dNTP（1mM） 4ul ；
10Xbuffer（含Mg2+，1Xbuffer中含2mM） 2ul；
ddH2O补齐至20ul。

该体系用做扩增叶绿体DNA时，完全没问题，但是在扩增核基因时，仅扩增出一次，就再也没扩增出来了。从扩增效果看，也并不是特别理想。以前做的时候，是用的公司提供的预混液mix，只需加入DNA、primers、Taq，拿水补齐就行了，且扩增结果稳定。现在用同样的扩增程序，可扩增结果怎么都出不来。试了很多次，更换引物（新合成的引物）、增加引物浓度（终浓度为0.3、0.5、1uM的都试过）、更换dNTP、更换DNA、增加DNA模版浓度（体系中30ng、40ng、50ng的都试过），但最终都是无结果。PCR扩增程序没问题的，因为之前用预混液做出来有结果的。只是现在没有条件了，没有再购买预混液了。

另外，不知道水是不是有问题？我做叶绿体基因的时候，扩增结果良好，扩增图谱比较清晰，但用同样的体系，只是更换引物，没有更换水，结果怎么都做不出来了，求大神帮忙.....
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1楼2015-01-21 22:19:46
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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我们都是模板和引物都是1ul别的没变。不知道你的体系对不对
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2楼2015-01-21 22:46:14
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芕星悦

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2015-01-21 22:46:14
我们都是模板和引物都是1ul别的没变。不知道你的体系对不对

因为引物浓度是2uM的，所以用了3ul，使其终浓度为0.3uM。模版的话30ng应该是足够的。
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3楼2015-01-22 00:08:21
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-01-23 13:47:21
引物和模板的浓度看起来是高了，但是如果已经对两者的浓度进行过摸索，还是没有得到结果的话，就可以考虑扩增时酶的问题（普通的Taq酶或者是热启动Taq酶）。
如果采用相同的体系，只是针对不同的DNA模板，其中一个DNA模板扩增完全没有问题，而另一个无论怎样进行体系优化也没有结果，说明问题是在DNA模板本身，是否是降解了，亦或是引物设计不合理，无法扩增。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-01-22 11:04:07
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小松果2012

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-23 13:47:25
最近也遇到这样的问题，怎么都P不出来，结果是换了一种蓝色的MIX P出来的，所以建议你还是用MIX试一下，因为我的超难P，最后换了之后也都P出来了。
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5楼2015-01-22 17:37:06
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这年头真难混

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-23 13:47:28
可以重提DNA在试一下，毕竟DNA放久效果肯定不如新，还扩不出来就试一下高保真的酶撒。还有PCR仪也可以换换，反正各种尝试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2015-01-22 23:42:14
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匿名

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-01-23 13:47:31
本帖仅楼主可见
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7楼2015-01-23 00:25:30
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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P的好好的，结果有个周怎么都P不出来了，歇息了一个周末再就做出来了，无果
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ControlMyself
8楼2015-01-23 09:01:50
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水无月小白

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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只能说可能是水的问题了 而且 是不是有可能是因为模板浓度太高 导致效率过低
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走自己的路
9楼2015-01-23 09:29:35
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qsy1115

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
芕星悦(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-02 21:12:24
单独跑下模板试试，看是否模板讲解，一般taq酶去扩应该都没啥问题的
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10楼2015-01-25 17:05:01
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