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求助PCR扩增不出来的问题..... 已有11人参与
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最近做分子实验PCR，总是做不出来，不知道哪位大侠能够指点一下.... PCR反应总体系为20 ul，其中包含： DNA（10 ng/ul） 3ul ； Primers（2 uM）上下游各3ul； Taq酶（5U/ul） 0.2ul； dNTP（1mM） 4ul ； 10Xbuffer（含Mg2+，1Xbuffer中含2mM） 2ul； ddH2O补齐至20ul。 该体系用做扩增叶绿体DNA时，完全没问题，但是在扩增核基因时，仅扩增出一次，就再也没扩增出来了。从扩增效果看，也并不是特别理想。以前做的时候，是用的公司提供的预混液mix，只需加入DNA、primers、Taq，拿水补齐就行了，且扩增结果稳定。现在用同样的扩增程序，可扩增结果怎么都出不来。试了很多次，更换引物（新合成的引物）、增加引物浓度（终浓度为0.3、0.5、1uM的都试过）、更换dNTP、更换DNA、增加DNA模版浓度（体系中30ng、40ng、50ng的都试过），但最终都是无结果。PCR扩增程序没问题的，因为之前用预混液做出来有结果的。只是现在没有条件了，没有再购买预混液了。 另外，不知道水是不是有问题？我做叶绿体基因的时候，扩增结果良好，扩增图谱比较清晰，但用同样的体系，只是更换引物，没有更换水，结果怎么都做不出来了，求大神帮忙..... |
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