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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 枯草芽孢杆菌PCR扩增不出来的问题
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)

[求助] 枯草芽孢杆菌PCR扩增不出来的问题已有7人参与

本人新入手了一株枯草芽孢杆菌，想进行基因敲除。可同源臂却一直扩增不出来。提的基因组甚至都跑了电泳，条带都能看得见，引物也是根据NCBI上的序列设计的。PCR用的东西都没有问题，中间引物也换了好几对了，也从其他实验室借过其他的枯草芽孢杆菌，但就是P不出来，这是怎么回事啊。
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1楼2014-08-25 09:45:38
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦锁深秋2005(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-25 22:47:23
梦锁深秋2005: 金币+5 2014-08-26 15:29:27
根据楼主提供的信息排除了模板有问题的情况，那多半是引物的问题，设计兼并引物试一下！祝好运！
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2楼2014-08-25 13:26:26
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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梦锁深秋2005: 金币+4 2014-08-26 15:29:48
引物有问题的可能性最大

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-08-25 14:26:34
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-25 14:26:34
引物有问题的可能性最大

我之前做的酵母，一直都是这样设计的引物，一直没有问题，引物换过好几对，也让之前做过枯草的人设计过，但就是不行
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4楼2014-08-25 15:46:01
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johnkm66

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
梦锁深秋2005(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:01:00
P不出来具体是什么情况？完全没有条带还是有但很淡？PCR不出结果的原因很多，包括模版、试剂、引物、操作等，甚至仪器也会有很大影响。
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5楼2014-08-26 14:32:43
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by johnkm66 at 2014-08-26 14:32:43
P不出来具体是什么情况？完全没有条带还是有但很淡？PCR不出结果的原因很多，包括模版、试剂、引物、操作等，甚至仪器也会有很大影响。

目的条带一点都没有，有时候会有一些杂带，有时候只有一些二聚体。试剂盒仪器等客观因素可以排除。
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6楼2014-08-26 15:32:21
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johnkm66

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
梦锁深秋2005(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:01:12
引用回帖:
6楼: Originally posted by 梦锁深秋2005 at 2014-08-26 15:32:21
目的条带一点都没有，有时候会有一些杂带，有时候只有一些二聚体。试剂盒仪器等客观因素可以排除。...

这样的话，首先检查引物设计，其次检查反应程序设计，第三注意操作细节。另外，请注意目标片段的大小和GC含量，GC含量高的话，是比较难扩的。如果是这样，需要选择一些相对高端的试剂盒，特别是对高GC含量有专门说明的产品。
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7楼2014-08-27 11:12:38
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小豆子J

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦锁深秋2005(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:01:31
同源臂的引物不像功能基因那样局限性很大，所以引物应该不会有问题，P不出条带换个PCR酶试试，我P过阳性菌的同源臂普通Taq酶P不出来，而Primer STAR酶就P出来了，而且可以缩短退火时间试试，模板量不要太多。
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8楼2014-08-27 13:50:13
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loveerobin

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
多设计几对引物
进行梯度PCR扩增试试
另外，扩增基因不是提了ＲＮＡ反转录吗？
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9楼2014-08-27 16:57:48
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a50044758

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦锁深秋2005: 金币+3 2014-09-01 08:20:43
换酶！反应体系里面加DMSO！
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10楼2014-08-27 22:55:53
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