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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 枯草芽孢杆菌转化假阳性
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苞谷芯

新虫 (初入文坛)

[求助] 枯草芽孢杆菌转化假阳性 已有2人参与

站内做枯草的前辈们帮忙分析一下吧，我现在在做枯草纳豆芽孢杆菌的基因敲除，用化转的方法把重组质粒转入纳豆菌后，在含红霉素（0.5μg/ml）的抗性平板上筛选转化子，我加不同浓度的质粒一共涂了16个平板，长了100多个形态看起来就是纳豆菌的菌落，可是用设计的引物PCR验证后却都不是，就很纳闷了，如果说我的质粒没有转进去，没有整合到菌体基因中，那这些菌在抗性平板上怎么会长呢？还那么多！是红霉素浓度太低了？可是浓度增高的话会不会抑制到转化子生长呢？什么原因呢？100多个没有一个是啊！帮忙分析一下吧~
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1楼 2013-09-03 15:27:44
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-03 22:38:18
一般情况下，使用红霉素终浓度是5μg/ml，估计你用的红霉素浓度太低了
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2楼2013-09-03 22:16:50
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苞谷芯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liygmail at 2013-09-03 22:16:50
一般情况下，使用红霉素终浓度是5μg/ml，估计你用的红霉素浓度太低了

3q for u answer，我也是参考文献上的，我看有的用0.3μg/ml，有的用0.5μg/ml就可以了,我怕浓度太高把我要的转化子也抑制了~我们之前也做过梯度从0.5μg/ml到2.5μg/ml每个梯度的平板上空白（感受态）也都会长两到三个~！今天早上优化培养基，做了个em1.0μg/ml的，明天看看结果怎样~
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3楼2013-09-04 14:19:05
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董丽红

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-12 12:14:09
我做的是枯草芽孢杆菌的基因敲除，转化时跟您出现了同样的问题，所使用的红霉素终浓度是5μg/ml，不知为何，不知现在您的问题解决没有？
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心无止境
4楼2013-09-08 17:40:04
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苞谷芯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 董丽红 at 2013-09-08 17:40:04
我做的是枯草芽孢杆菌的基因敲除，转化时跟您出现了同样的问题，所使用的红霉素终浓度是5μg/ml，不知为何，不知现在您的问题解决没有？

没有呢，提高红霉素浓度之后长出来的菌pcr验证之后还是不是，现在就在查文献试着优化化转条件看看结果怎样！
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5楼2013-09-12 09:58:39
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生物工程师

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我遇到了类似的情况，我的含有Ery抗性质粒的DH5a能在抗生素培养基上生长，但是之后的提取质粒提不到任何东西（电泳看不到任何东西）。我觉得可能是红霉素的问题。我是用无水乙醇制备的红霉素溶液，你也是吗？希望能通过交流解决这个问题。
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6楼2013-12-01 09:30:45
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生物工程师

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

建议做一个阴性对照，即把不含敲除质粒的枯草芽孢杆菌培养在含红霉素的培养基中，如果也能长出来，可能就是抗生素的问题了，我现在正在做这个对照试验，你也可以等我的结果。
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7楼2013-12-01 09:41:25
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

红霉素本来就不好用，换一个抗生素标记，比如Amp或者kana看他还长不长。所以淡定就好。
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8楼2014-02-20 15:48:23
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wangdajing

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主，枯草芽孢杆菌的菌落PCR应该怎么做？提取质粒之前应该如何处理菌呢？
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9楼2017-10-18 16:07:15
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