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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 枯草芽孢杆菌基因敲除后的回补实验
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zd1213

银虫 (小有名气)

[求助] 枯草芽孢杆菌基因敲除后的回补实验

本人前期在枯草芽孢杆菌敲除了一个基因，现在要进行回补实验验证，就是把敲掉的基因再整合到基因组上。看了很多文献，还是没有清晰的思路。比如：
1、这段基因就简单的PCR从起始密码子到终止密码子就够了还是需要长一点？如果需要片段长一点是到上游多少bp才可以？
2、我们实验室只有一种自杀质粒，是否可以用来操作这个回补实验？
3、很多文献都用到淀粉酶基因amyE，用途是什么呢？

这些我都不是很清楚啊~本人也即将面临毕业了，还有这个实验卡在这，实在是纠结啊！恳请请各位高手指点！
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1楼2012-07-02 17:25:24
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回帖置顶 ( 共有1个 )

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zd1213: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-07-02 20:01:14
amisking: 回帖置顶 2012-07-02 20:02:36
complemental assay很简单的。
既然你敲除了目的基因，相比野生型会有一些表型变化或者别的变化，将这段基因扩增出来，连接至一个可以进行高表达的载体上，然后将重组载体转化进突变体中，测定其表型是否已经恢复至了野生型即可！
ps：互补载体，很多的，只要可以启动你基因的表达就OK了！
祝好运！
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4楼2012-07-02 19:17:28
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zd1213: 金币+1, ★有帮助 2012-07-02 18:47:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-04 13:50:44
前两个都不懂，鸭梨好大
只回答第三个问题：amyE是枯草芽孢杆菌淀粉酶基因，因为这个基因不是太重要，常用作在基因组上的整合位点，不知道你回补实验基因是不是要整合到它上面？
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2楼2012-07-02 18:37:12
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zd1213

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-07-02 18:37:12
前两个都不懂，鸭梨好大
只回答第三个问题：amyE是枯草芽孢杆菌淀粉酶基因，因为这个基因不是太重要，常用作在基因组上的整合位点，不知道你回补实验基因是不是要整合到它上面？

非常感谢！
这个淀粉酶基因的作用是什么呢？便于筛选还是起到启动子的作用呀？不太明白~如果我不用这个基因，可以做吗？
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3楼2012-07-02 18:50:31
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zd1213

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 天使托 at 2012-07-02 19:17:28
complemental assay很简单的。
既然你敲除了目的基因，相比野生型会有一些表型变化或者别的变化，将这段基因扩增出来，连接至一个可以进行高表达的载体上，然后将重组载体转化进突变体中，测定其表型是否已经恢复至 ...

非常感谢！
我用的是野生型的枯草芽孢杆菌，没有经过任何改造，担心用表达载体基因无法表达，因为枯草会分泌很多蛋白酶~所以我才想把回补的基因整合到基因组上。我们实验室没有其它整合载体，只有一个自杀质粒载体，我可以直接用吗？
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5楼2012-07-02 20:08:34
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
5楼: Originally posted by zd1213 at 2012-07-02 20:08:34
非常感谢！
我用的是野生型的枯草芽孢杆菌，没有经过任何改造，担心用表达载体基因无法表达，因为枯草会分泌很多蛋白酶~所以我才想把回补的基因整合到基因组上。我们实验室没有其它整合载体，只有一个自杀质粒载体 ...

自杀质粒载体肯定不能用的嘛，至少这个载体上有启动子，有一定的筛选标记才可以i的！
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6楼2012-07-03 16:59:37
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
zd1213: 金币+1, ★有帮助 2012-07-03 19:19:22
引用回帖:
3楼: Originally posted by zd1213 at 2012-07-02 18:50:31
非常感谢！
这个淀粉酶基因的作用是什么呢？便于筛选还是起到启动子的作用呀？不太明白~如果我不用这个基因，可以做吗？...

应该是是便于筛选，因为淀粉酶基因失活了后在含淀粉的培养基上生长时就不能分解淀粉形成透明圈了~~~~
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7楼2012-07-03 18:05:58
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zd1213

银虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-04 13:51:04
引用回帖:
6楼: Originally posted by 天使托 at 2012-07-03 16:59:37
自杀质粒载体肯定不能用的嘛，至少这个载体上有启动子，有一定的筛选标记才可以i的！...

我不是很懂为什么不能用自杀质粒整合到基因组来表达，还望高手指点一下~如果我构建如下：
基因L臂+启动子+基因+基因R臂，再连接到自杀质粒，替换掉我之前敲除的那部分，这样可以吗？自杀质粒本身有抗性标记。
如果实在是不可以，我只能用表达载体了，主要是以前到野生菌表达的都没有酶活，不敢冒险了~而且枯草野生菌的转化非常困难，心里没底……
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8楼2012-07-03 19:15:21
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zd1213

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-07-03 18:05:58
应该是是便于筛选，因为淀粉酶基因失活了后在含淀粉的培养基上生长时就不能分解淀粉形成透明圈了~~~~...

谢谢！
这个点终于明白了~不过好像构建起来有点小麻烦，我就想着越简单越好~快毕业的人伤不起啊……
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9楼2012-07-03 19:19:08
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
8楼: Originally posted by zd1213 at 2012-07-03 19:15:21
我不是很懂为什么不能用自杀质粒整合到基因组来表达，还望高手指点一下~如果我构建如下：
基因L臂+启动子+基因+基因R臂，再连接到自杀质粒，替换掉我之前敲除的那部分，这样可以吗？自杀质粒本身有抗性标记。
如 ...

你至少得保证你的基因连接到自杀质粒上可以表达，如果不能表达那肯定不行的！
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10楼2012-07-04 11:19:27
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