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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 枯草芽孢杆菌基因敲除后的回补实验
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zd1213

银虫 (小有名气)

[求助] 枯草芽孢杆菌基因敲除后的回补实验

本人前期在枯草芽孢杆菌敲除了一个基因，现在要进行回补实验验证，就是把敲掉的基因再整合到基因组上。看了很多文献，还是没有清晰的思路。比如：
1、这段基因就简单的PCR从起始密码子到终止密码子就够了还是需要长一点？如果需要片段长一点是到上游多少bp才可以？
2、我们实验室只有一种自杀质粒，是否可以用来操作这个回补实验？
3、很多文献都用到淀粉酶基因amyE，用途是什么呢？

这些我都不是很清楚啊~本人也即将面临毕业了，还有这个实验卡在这，实在是纠结啊！恳请请各位高手指点！
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1楼 2012-07-02 17:25:24
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zd1213: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-07-02 20:01:14
amisking: 回帖置顶 2012-07-02 20:02:36
complemental assay很简单的。
既然你敲除了目的基因，相比野生型会有一些表型变化或者别的变化，将这段基因扩增出来，连接至一个可以进行高表达的载体上，然后将重组载体转化进突变体中，测定其表型是否已经恢复至了野生型即可！
ps：互补载体，很多的，只要可以启动你基因的表达就OK了！
祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2012-07-02 19:17:28
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zd1213: 金币+1, ★有帮助 2012-07-02 18:47:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-04 13:50:44
前两个都不懂，鸭梨好大
只回答第三个问题：amyE是枯草芽孢杆菌淀粉酶基因，因为这个基因不是太重要，常用作在基因组上的整合位点，不知道你回补实验基因是不是要整合到它上面？
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2楼2012-07-02 18:37:12
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zd1213

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-07-02 18:37:12
前两个都不懂，鸭梨好大
只回答第三个问题：amyE是枯草芽孢杆菌淀粉酶基因，因为这个基因不是太重要，常用作在基因组上的整合位点，不知道你回补实验基因是不是要整合到它上面？

非常感谢！
这个淀粉酶基因的作用是什么呢？便于筛选还是起到启动子的作用呀？不太明白~如果我不用这个基因，可以做吗？
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3楼2012-07-02 18:50:31
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zd1213

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 天使托 at 2012-07-02 19:17:28
complemental assay很简单的。
既然你敲除了目的基因，相比野生型会有一些表型变化或者别的变化，将这段基因扩增出来，连接至一个可以进行高表达的载体上，然后将重组载体转化进突变体中，测定其表型是否已经恢复至 ...

非常感谢！
我用的是野生型的枯草芽孢杆菌，没有经过任何改造，担心用表达载体基因无法表达，因为枯草会分泌很多蛋白酶~所以我才想把回补的基因整合到基因组上。我们实验室没有其它整合载体，只有一个自杀质粒载体，我可以直接用吗？
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5楼2012-07-02 20:08:34
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