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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » red敲除 pij778抗性实验求助！
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zhengwei188

木虫 (正式写手)

[求助] red敲除 pij778抗性实验求助！

你好，我的质粒做过一次敲除，用得是pij778，抗性自然是壮观霉素和链霉素，然后我用773再次敲除一次，抗性涂得 是安普霉素，结果长了满个平板，试过两次了还是这样，究竟是怎么回事呢，是不是pij778有这个抗性，我用的宿主是bw25113（pkd46）难道这个带安普抗性吗，求助谢谢！

[ 来自小组 药物化学家族 ]
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1楼 2013-09-07 16:02:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhengwei188: 金币+1, ★★★很有帮助, 那如何能让pkd46消失，然后保留菌株内只有我自己的质粒呢，求方法，谢谢！我在42度放置了一个小时，然后放到37度过夜养了一下， 发现还是会有菌产生，但是就是少一些！ 2013-09-14 12:07:42
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-15 13:45:42
zhengwei188: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2013-09-25 19:06:06
pkd46就是amp的  不过需要在30°长，在37°长得不太好就是了（但当然可以长出来，尤其bla还是分泌蛋白）
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3楼2013-09-09 03:17:16
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:07:09
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhengwei188 at 2013-09-24 09:29:20
我把液体LB放到42度一个小时，然后分成两个瓶，一个加了氨苄，在37度培养一夜发现还长哈！...

确保你挑单菌落。。
42°只是阻止质粒复制  不是让质粒消失，你放42°，菌又死不了，再放37°当然又长出来了
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9楼2013-09-24 10:08:57
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txy8469393

木虫 (小有名气)

拿着扫把的研究僧

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhengwei188: 金币+1, 谢谢，我做 2013-09-14 12:01:20
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-15 13:45:26
你这个敲出很有问题啊，773也会会把778敲掉的，为什么不先做In-frame deletion。
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找我请打110,你别看我拿着扫把,其实我是弹吉他的!
2楼2013-09-08 22:42:53
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-15 13:45:50
zhengwei188: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-23 09:59:41
42度养，划单菌，然后37度长

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2013-09-14 13:17:42
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-26 15:06:54
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhengwei188 at 2013-09-23 09:59:10
谢谢，42度养是养一宿吗，还是养几个小时。...

随意，只要你确定分裂了几代就行
我一般都不专门去消pKD46，敲除后的37°培养基本就消干净了。

我消PCP20（同样origin），是先37°长一会（短线）鉴定（确认flp loopout），然后挑到液体LB里37放3hr，然后划平板37°overnight，挑单菌基本都没有抗性。
如果用42°消应该更容易。
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7楼2013-09-23 22:22:21
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普通回帖

zhengwei188

木虫 (正式写手)
如何能将pkd46去掉呢？
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4楼2013-09-14 12:10:45
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zhengwei188

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-09-14 13:17:42
42度养，划单菌，然后37度长

谢谢，42度养是养一宿吗，还是养几个小时。
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6楼2013-09-23 09:59:10
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zhengwei188

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-09-23 22:22:21
随意，只要你确定分裂了几代就行
我一般都不专门去消pKD46，敲除后的37°培养基本就消干净了。

我消PCP20（同样origin），是先37°长一会（短线）鉴定（确认flp loopout），然后挑到液体LB里37放3hr，然后划平 ...

我把液体LB放到42度一个小时，然后分成两个瓶，一个加了氨苄，在37度培养一夜发现还长哈！
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8楼2013-09-24 09:29:20
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zhengwei188

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-09-24 10:08:57
确保你挑单菌落。。
42°只是阻止质粒复制  不是让质粒消失，你放42°，菌又死不了，再放37°当然又长出来了...

谢谢，我也考虑是这个原因了
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10楼2013-09-25 19:04:31
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