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zd1213

银虫 (小有名气)

[求助] 枯草芽孢杆菌基因敲除后的回补实验

本人前期在枯草芽孢杆菌敲除了一个基因,现在要进行回补实验验证,就是把敲掉的基因再整合到基因组上。看了很多文献,还是没有清晰的思路。比如:
1、这段基因就简单的PCR从起始密码子到终止密码子就够了还是需要长一点?如果需要片段长一点是到上游多少bp才可以?
2、我们实验室只有一种自杀质粒,是否可以用来操作这个回补实验?
3、很多文献都用到淀粉酶基因amyE,用途是什么呢?

这些我都不是很清楚啊~本人也即将面临毕业了,还有这个实验卡在这,实在是纠结啊!恳请请各位高手指点!
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zd1213

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-07-02 18:37:12
前两个都不懂,鸭梨好大
只回答第三个问题:amyE是枯草芽孢杆菌淀粉酶基因,因为这个基因不是太重要,常用作在基因组上的整合位点,不知道你回补实验基因是不是要整合到它上面?

非常感谢!
这个淀粉酶基因的作用是什么呢?便于筛选还是起到启动子的作用呀?不太明白~如果我不用这个基因,可以做吗?
3楼2012-07-02 18:50:31
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zd1213: 金币+1, 有帮助 2012-07-02 18:47:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-04 13:50:44
前两个都不懂,鸭梨好大
只回答第三个问题:amyE是枯草芽孢杆菌淀粉酶基因,因为这个基因不是太重要,常用作在基因组上的整合位点,不知道你回补实验基因是不是要整合到它上面?
2楼2012-07-02 18:37:12
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zd1213: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-07-02 20:01:14
amisking: 回帖置顶 2012-07-02 20:02:36
complemental assay很简单的。
既然你敲除了目的基因,相比野生型会有一些表型变化或者别的变化,将这段基因扩增出来,连接至一个可以进行高表达的载体上,然后将重组载体转化进突变体中,测定其表型是否已经恢复至了野生型即可!
ps:互补载体,很多的,只要可以启动你基因的表达就OK了!
祝好运!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2012-07-02 19:17:28
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zd1213

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 天使托 at 2012-07-02 19:17:28
complemental assay很简单的。
既然你敲除了目的基因,相比野生型会有一些表型变化或者别的变化,将这段基因扩增出来,连接至一个可以进行高表达的载体上,然后将重组载体转化进突变体中,测定其表型是否已经恢复至 ...

非常感谢!
我用的是野生型的枯草芽孢杆菌,没有经过任何改造,担心用表达载体基因无法表达,因为枯草会分泌很多蛋白酶~所以我才想把回补的基因整合到基因组上。我们实验室没有其它整合载体,只有一个自杀质粒载体,我可以直接用吗?
5楼2012-07-02 20:08:34
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