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苞谷芯

新虫 (初入文坛)

[求助] 枯草芽孢杆菌转化假阳性 已有2人参与

站内做枯草的前辈们帮忙分析一下吧,我现在在做枯草纳豆芽孢杆菌的基因敲除,用化转的方法把重组质粒转入纳豆菌后,在含红霉素(0.5μg/ml)的抗性平板上筛选转化子,我加不同浓度的质粒一共涂了16个平板,长了100多个形态看起来就是纳豆菌的菌落,可是用设计的引物PCR验证后却都不是,就很纳闷了,如果说我的质粒没有转进去,没有整合到菌体基因中,那这些菌在抗性平板上怎么会长呢?还那么多!是红霉素浓度太低了?可是浓度增高的话会不会抑制到转化子生长呢?什么原因呢?100多个没有一个是啊!帮忙分析一下吧~
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苞谷芯

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 董丽红 at 2013-09-08 17:40:04
我做的是枯草芽孢杆菌的基因敲除,转化时跟您出现了同样的问题,所使用的红霉素终浓度是5μg/ml,不知为何,不知现在您的问题解决没有?

没有呢,提高红霉素浓度之后长出来的菌pcr验证之后还是不是,现在就在查文献试着优化化转条件看看结果怎样!
5楼2013-09-12 09:58:39
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-03 22:38:18
一般情况下,使用红霉素终浓度是5μg/ml,估计你用的红霉素浓度太低了
2楼2013-09-03 22:16:50
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苞谷芯

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by liygmail at 2013-09-03 22:16:50
一般情况下,使用红霉素终浓度是5μg/ml,估计你用的红霉素浓度太低了

3q for u answer,我也是参考文献上的,我看有的用0.3μg/ml,有的用0.5μg/ml就可以了,我怕浓度太高把我要的转化子也抑制了~我们之前也做过梯度从0.5μg/ml到2.5μg/ml每个梯度的平板上空白(感受态)也都会长两到三个~!今天早上优化培养基,做了个em1.0μg/ml的,明天看看结果怎样~
3楼2013-09-04 14:19:05
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董丽红

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-12 12:14:09
我做的是枯草芽孢杆菌的基因敲除,转化时跟您出现了同样的问题,所使用的红霉素终浓度是5μg/ml,不知为何,不知现在您的问题解决没有?
心无止境
4楼2013-09-08 17:40:04
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