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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 枯草芽孢杆菌PCR扩增不出来的问题
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)

[求助] 枯草芽孢杆菌PCR扩增不出来的问题 已有7人参与

本人新入手了一株枯草芽孢杆菌，想进行基因敲除。可同源臂却一直扩增不出来。提的基因组甚至都跑了电泳，条带都能看得见，引物也是根据NCBI上的序列设计的。PCR用的东西都没有问题，中间引物也换了好几对了，也从其他实验室借过其他的枯草芽孢杆菌，但就是P不出来，这是怎么回事啊。
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1楼 2014-08-25 09:45:38
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johnkm66

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
梦锁深秋2005(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:01:12
引用回帖:
6楼: Originally posted by 梦锁深秋2005 at 2014-08-26 15:32:21
目的条带一点都没有，有时候会有一些杂带，有时候只有一些二聚体。试剂盒仪器等客观因素可以排除。...

这样的话，首先检查引物设计，其次检查反应程序设计，第三注意操作细节。另外，请注意目标片段的大小和GC含量，GC含量高的话，是比较难扩的。如果是这样，需要选择一些相对高端的试剂盒，特别是对高GC含量有专门说明的产品。
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7楼2014-08-27 11:12:38
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦锁深秋2005(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-25 22:47:23
梦锁深秋2005: 金币+5 2014-08-26 15:29:27
根据楼主提供的信息排除了模板有问题的情况，那多半是引物的问题，设计兼并引物试一下！祝好运！
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2楼2014-08-25 13:26:26
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
梦锁深秋2005: 金币+4 2014-08-26 15:29:48
引物有问题的可能性最大

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-08-25 14:26:34
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-25 14:26:34
引物有问题的可能性最大

我之前做的酵母，一直都是这样设计的引物，一直没有问题，引物换过好几对，也让之前做过枯草的人设计过，但就是不行
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4楼2014-08-25 15:46:01
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