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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)

[求助] 枯草芽孢杆菌PCR扩增不出来的问题 已有7人参与

本人新入手了一株枯草芽孢杆菌,想进行基因敲除。可同源臂却一直扩增不出来。提的基因组甚至都跑了电泳,条带都能看得见,引物也是根据NCBI上的序列设计的。PCR用的东西都没有问题,中间引物也换了好几对了,也从其他实验室借过其他的枯草芽孢杆菌,但就是P不出来,这是怎么回事啊。
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
梦锁深秋2005(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-25 22:47:23
梦锁深秋2005: 金币+5 2014-08-26 15:29:27
根据楼主提供的信息排除了模板有问题的情况,那多半是引物的问题,设计兼并引物试一下!祝好运!
2楼2014-08-25 13:26:26
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)


【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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梦锁深秋2005: 金币+4 2014-08-26 15:29:48
引物有问题的可能性最大

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-08-25 14:26:34
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-25 14:26:34
引物有问题的可能性最大

我之前做的酵母,一直都是这样设计的引物,一直没有问题,引物换过好几对,也让之前做过枯草的人设计过,但就是不行
4楼2014-08-25 15:46:01
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johnkm66

新虫 (初入文坛)


【答案】应助回帖


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梦锁深秋2005(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:01:00
P不出来具体是什么情况?完全没有条带还是有但很淡?PCR不出结果的原因很多,包括模版、试剂、引物、操作等,甚至仪器也会有很大影响。
5楼2014-08-26 14:32:43
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梦锁深秋2005

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by johnkm66 at 2014-08-26 14:32:43
P不出来具体是什么情况?完全没有条带还是有但很淡?PCR不出结果的原因很多,包括模版、试剂、引物、操作等,甚至仪器也会有很大影响。

目的条带一点都没有,有时候会有一些杂带,有时候只有一些二聚体。试剂盒仪器等客观因素可以排除。
6楼2014-08-26 15:32:21
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johnkm66

新虫 (初入文坛)


【答案】应助回帖

★ ★
梦锁深秋2005(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:01:12
引用回帖:
6楼: Originally posted by 梦锁深秋2005 at 2014-08-26 15:32:21
目的条带一点都没有,有时候会有一些杂带,有时候只有一些二聚体。试剂盒仪器等客观因素可以排除。...

这样的话,首先检查引物设计,其次检查反应程序设计,第三注意操作细节。另外,请注意目标片段的大小和GC含量,GC含量高的话,是比较难扩的。如果是这样,需要选择一些相对高端的试剂盒,特别是对高GC含量有专门说明的产品。
7楼2014-08-27 11:12:38
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小豆子J

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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梦锁深秋2005(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:01:31
同源臂的引物不像功能基因那样局限性很大,所以引物应该不会有问题,P不出条带换个PCR酶试试,我P过阳性菌的同源臂普通Taq酶P不出来,而Primer STAR酶就P出来了,而且可以缩短退火时间试试,模板量不要太多。
8楼2014-08-27 13:50:13
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loveerobin

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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多设计几对引物
进行梯度PCR扩增试试
另外,扩增基因不是提了RNA反转录吗?
9楼2014-08-27 16:57:48
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a50044758

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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梦锁深秋2005: 金币+3 2014-09-01 08:20:43
换酶!反应体系里面加DMSO!
10楼2014-08-27 22:55:53
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