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高GC模版扩增不出条带，求PCR高手 已有4人参与
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本人研究的是蛋白核小球藻中跟固碳相关的一个基因，想通过cDNA扩增该基因的全长，我们这个物种本来就GC含量很高，之前用过transgene的fastPfu酶扩增出来过一次，后来就再也重复不出来了，现在重新设计了引物，换了论坛里有人推荐的toyobo的KOD FX NEO的酶，退火温度也摸索了（55-75℃），就是没条带啊 ，看网上说加DMSO、betaine等，也不知道效果到底有多高，求高手指点该基因CDS序列：GCAACAATGCCCCAAACGAAGCGGGCAGAGCCGCCGACCGAGGAGGAGAAGGCTCGCATCGTGACTGGCCCGGACCCCGATCGGTTCTACTGCCCCCATCCAGGATGTAATCGCTCCTTTGCCGAGCTCTGGCGGCTCAAGGTCCACTTCCGTGCGCCACCCGACGTGCGCGGCAGCGGCAAGGAGCGCGGCCACGGCACCGAGCTGCAGTTCTGCCCAAAGTGTGGAAAGGACCTGCGGCCCGGCAAGCACCATGTGGGCTGCTCCGCCGGCAAGAGCGCCCCGCGGCAGGCAGCTAAGCGGCAGCGGCAGCAACAAATGAGCACGACCACCGAAAGTGCGGGGCTCACCACCGGCACCACGGAGCAGACCACCACTGGCAGCTGGGAGCTGACGGCGCCTGCACGGCGGCCGCCCGCCAAGACGCAGCGGCAGGCCAGTGAGGCCGAGTCGGCGCAGCGCACCAAGCGCGCCGCCGAGGCGGCGGCGGCCGTGGGAGGCCAGCCCGGCGAGCTGGTCTACCAGCCTGGCGGCCCCATGGGGgCGGGCGGCCACATGcTCCCCCCCGGGCAGCACCAGCACCACCTGCAGGGCTTCTACCCGCAGCACGGCCAGGGCGGCGCGGCGCCGCCGCCGGCGGGCGCGCAGCAGCACGCGGCGCCGCCCGCGCAGATGGCCCCGCTGCCACACCTCGACCTGCCGCACAACCCCGCGGGCGAGGCCCGCGCGCAcTCCCCcTCCCCCCTCGACCTCTTTGGGGACCCCTTTgCGGGGGCGACCAACGGGCAGGCCGGAGGCGACCCCGGCCGCGGCGGCAGCAACGGCCTGCACGGTCTGCTTGAAGAGGATGAGCTGCTGCGCATCCCCTCGCCGCCGCCGCTGCCGGCAGAGTGGGAGAGCGCGGCTGCGCGGCCGGGCATGCTGTTTGACTTTGACCAGTTTGACATCAACAAGCGGCAGCAGCAGGCGGGCGGCGCCTCGGCCCCGCTGGTGACCGTGACCACCGCCATGAACCCGGTGGATGTGCTCAACCCCTCGGACGACTACATCTGGCAGATCCTGTTTGCGGGGGAgAACGACGCGGTGCCCAAGCGCGTCACGGCACGCGCAGCACATGCAGCCGCaGTACCGCAACGGGTATGGCGGGCATGGCGCcGCCGGCGAGCTGcACCcGTGAAGCTGgAGGGgACGGCCGCGGGAGGCTTCATTTGAACACACATACTGCGAG 第一次设计的引物：F：5' GCAACAATGCCCCAAACGAAG 3' R：5' CTCGCAGTATGTGTGTTCAAATG 3' 第二次设计的引物加入了UTR序列，尽量降低了错误起始率，F：5' GCAACAATGCCCCAAACGAA 3' R：5' TGTGTGTTCAAATGAAGCCTC 3' 这是oligo对第二次引物的PCR评价 Set score: 196 F/R PCR Product Optimal Annealing Temperature: 63.7 °C (Max: 68.2 °C) ---------------------------------------------------------------------------- Position Length Tm [°C] GC [%] P.E.# Score ---------------------------------------------------------------------------- F/R Product n/a 1219 96.4 71.9 n/a 196 Forward Primer 12 20 58.9 50.0 495/495 919 Reverse Primer 1210 21 57.2 42.9 453/453 812 ---------------------------------------------------------------------------- Product Tm - Reverse Primer Tm: 39.2 °C Primers Tm difference: 1.7 °C Comments: High difference between (F/R) product and primer melting temperatures. |
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