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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增结果不好
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小绘64

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增结果不好

前三个一组，中间三个一组，后三个一组。 每组的最后一个是空白对照。
每组用的模板都是一样的，引物不一样。
第一组扩增效果比较好，下面也没有引物条带，后两组扩增效率太低，有明显的引物条带。。。请问大家可以从哪些方面优化条件？

5.2-2.jpg
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1楼 2013-05-02 17:14:22
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guaiyaya

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这个没有扩出来吧。。。多长的片段？
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2楼2013-05-02 17:55:20
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710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小绘64(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-04 01:36:19
要是引物没问题的话，那就做个梯度PCR，改变退火温度试试，应该没有大问题
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may
3楼2013-05-02 18:03:16
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baseball

禁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小绘64: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-05-02 21:01:22
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 22:08:13
本帖内容被屏蔽
4楼2013-05-02 20:06:01
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小绘64

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guaiyaya at 2013-05-02 17:55:20
你这个没有扩出来吧。。。多长的片段？

84bp,扩增位置是对的。
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5楼2013-05-02 20:49:30
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小绘64

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 710002191 at 2013-05-02 18:03:16
要是引物没问题的话，那就做个梯度PCR，改变退火温度试试，应该没有大问题

梯度PCR指的是退火温度梯度吗？这个做了的，选定了条带较亮时的温度，但效果还是不理想。
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6楼2013-05-02 20:51:28
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小绘64

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by baseball at 2013-05-02 20:06:01
说不定是酶的问题，我们实验室尝试过Premix Ex Taq 和 Phusion, 结果都不好，换了PrimeSTAR GXL所有原来做不出来的都出产物了

有可能是酶的问题，我这个体系比较特殊，能用的酶有限，还要多看文献找一下，谢谢哈
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7楼2013-05-02 20:54:31
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study韩

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小绘64(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 22:08:23
第一，目的片段太小，退火温度设置的比较低，因此易出现引物条带！你可以做一个梯度吧，我觉得！第二，和酶肯定也有关系，不同的酶最适温度肯定不一样，所以酶也需要考虑下！第三，引物特异性应该仍需加强，毕竟片段有点短！希望你能成功哈！
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8楼2013-05-02 22:04:28
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guaiyaya

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 小绘64 at 2013-05-02 20:49:30
84bp,扩增位置是对的。...

那你做个巢式PCR试试，特异性很高的
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9楼2013-05-03 08:29:30
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mruber

金虫 (小有名气)
我也觉得扩增时对酶的选择很重要。不同品牌的差别还是比较大。另外就是要选择适宜的扩增温度和条件，同时仔细阅读厂商推荐的说明书。
推荐你使用KOD系列(TOYOBO),我一直都用，扩增效率杠杠的。
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10楼2013-05-03 21:31:24
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