| 查看: 1373 | 回复: 4 | ||||
博克侬浮码银虫 (小有名气)
|
[求助]
反向PCR扩不出来
|
| 最近在扩PCR，有一个基因明明已经扩出来了，但是用这个基因的序列扩反向PCR却怎么都扩不出来，请各位前辈们支支招，不胜感激！ |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有286人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求助做反向PCR的高手们
已经有9人回复
- 质粒PCR产物片段大小问题
已经有15人回复
- 关于一对引物同时扩增多个不同基因的问题
已经有10人回复
- 关于PCR 扩增 引物可以扩增多长的模板
已经有4人回复
- 设计了简并引物，PCR扩不出条带
已经有9人回复
- PCR扩增不出目的条带
已经有12人回复
- PCR回收产物做PCR模板，为什么扩不出来
已经有8人回复
- PCR的正向引物和反向引物可以一起存放吗?
已经有19人回复
- PCR重复不出来
已经有20人回复
- 反转录之后PCR扩增片段问题的请教，急急急
已经有5人回复
- overlap PCR做不出来呐。。。。
已经有23人回复
- PCR一直扩不出目的条带
已经有10人回复
- 反向PCR之单引物扩增，真悲剧
已经有15人回复
- PCR扩不出目的基因
已经有14人回复
- 反向PCR求助！
已经有14人回复
- 请教real time pcr问题，谢谢！
已经有10人回复
- 【求助/交流】pcr条带不亮
已经有6人回复
- 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题
已经有21人回复
- 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接
已经有10人回复
- 【求助/交流】反向PCR的问题
已经有11人回复
- 怎么扩不出来
已经有7人回复
- PCR刚开始扩的很好，后来就扩不出来了怎么回事？
已经有35人回复
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
博克侬浮码(西门吹雪170代发): 金币+6, 鼓励回帖交流 2014-07-17 12:21:32
感谢参与，应助指数 +1
博克侬浮码(西门吹雪170代发): 金币+6, 鼓励回帖交流 2014-07-17 12:21:32
|
反向PCR操作应该注意 1.分离的基因组DNA应该达到一定纯度，以利用后面的酶切、连接盒PCR扩增。还要足以用超滤方法除去乙醇，不然连接反应会有困难。DNA溶解于TE缓冲溶液中，pH=8.0。 2.基因组DNA的复杂程度不要太高，一般大于10的9次方的基因组需要构建一些小一些的基因文库。 3.对于限制性内切酶的选择有一定要求。（1）一般需要限制性内切酶需要把DNA切割为2-3Kb的片段，作为反向PCR扩增片段比较好，如果太短可能因为要扩增的DNA序列中相当部分是未知序列（因为也没有必要去测序，要是对于需要扩增的DNA全部序列都测定出来了，那就不用做反向PCR了），无法提供做够的PCR扩增的信息，连接时可能也会有麻烦出现；太长了反向PCR扩增反应体系可能无法有效完成。貌似长片段PCR体系尚未有效应用于反向PCR。（2）限制性内切酶在选择时要考虑DNA扩增片段的G+C 的含量。（3）酶切反应时尽量保证在限制性内切酶的最适反应条件下进行，以避免星号活性出现。商业用酶试剂经常还有相当数量的甘油，在酶切反应前一般应该用超滤去除掉甘油，然后再加入有关酶的缓冲溶液，这不就用不着使用分子筛更换缓冲溶液的操作了，除非实验者的确非常急于练习使用分子筛更换缓冲溶液的操作，而且正好有现成的已经转配好的层析柱。  （4）一般地，粘性末端的连接效率高于平头末端连接很多。4.被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化。 T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。T4DNA连接酶在分子生物学中有广泛的应用。 被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化反应体系： 10X连接酶缓冲溶液： 10μL（购买T4 DNA Ligase商家会提供，使用时稀释10倍）,限制性内切酶DNA片段：5μL（溶解于TE缓冲溶液中，pH=8.0）， T4 DNA 连接酶 ：1μL， 无菌水： 84μL 限制性内切酶DNA片段终浓度一般不超过 3ng/μL，反应体系中的T4 DNA 连接酶用量可按产品说明书配制，一般对于上述反应体系而言，2.5U 的T4 DNA 连接酶足够了。被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化反应体系可在14摄氏度的水浴中过夜（大概13-18小时），然后升温至约65摄氏度使T4 DNA 连接酶失活已终止反应。很多书上对于自身环化反应的试验流程说的不清楚，所以我完整写出来，以供参考。当然也文献上说：被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化仅需要在16摄氏度水浴中1小时即可升温至约65摄氏度使T4 DNA 连接酶失活已终止反应。 （5）一般而言，被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化后，还是需要用新的针对于已知序列的那部分DNA片段进行再次限制性酶切，形成新的已知序列的那部分DNA片段在外侧的线状DNA，这样PCR就变成普通的PCR，效率会比直接对于环形DNA模板要高，因为至少环状DNA要考虑到DNA由于螺旋压紧而形成的复制阻力，PCR反应可是没有DNA拓扑异构酶来消除由于螺旋压紧而形成的复制阻力，也没有证据表明任何被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化后都会有足够的左手螺旋足以克服由于螺旋压紧而形成的复制阻力。 （6）第一轮PCR之后，用电泳检测，如果目标带不够窄和量，或有杂带出现，一般需要进行嵌套PCR再次扩增，需要至少一个不同于第一次PCR的引物的新引物。 今天凌晨刚刚写完的。仅供参考！ |
2楼2014-07-17 02:56:29
博克侬浮码
银虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 318.5
- 散金: 406
- 帖子: 107
- 在线: 47.4小时
- 虫号: 2814101
- 注册: 2013-11-20
- 专业: 病原微生物变异与耐药
3楼2014-07-17 09:32:47
luwei13566
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 184 (高中生)
- 金币: 4352.9
- 散金: 97
- 红花: 35
- 帖子: 641
- 在线: 261.1小时
- 虫号: 2380655
- 注册: 2013-03-27
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
4楼2014-07-17 11:06:02
博克侬浮码
银虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 318.5
- 散金: 406
- 帖子: 107
- 在线: 47.4小时
- 虫号: 2814101
- 注册: 2013-11-20
- 专业: 病原微生物变异与耐药
5楼2014-07-19 15:16:48
