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博克侬浮码

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[求助] 反向PCR扩不出来

最近在扩PCR，有一个基因明明已经扩出来了，但是用这个基因的序列扩反向PCR却怎么都扩不出来，请各位前辈们支支招，不胜感激！

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1楼2014-07-16 16:08:19

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凌波丽

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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博克侬浮码(西门吹雪170代发): 金币+6, 鼓励回帖交流 2014-07-17 12:21:32

反向PCR操作应该注意

1.分离的基因组DNA应该达到一定纯度，以利用后面的酶切、连接盒PCR扩增。还要足以用超滤方法除去乙醇，不然连接反应会有困难。DNA溶解于TE缓冲溶液中，pH=8.0。
2.基因组DNA的复杂程度不要太高，一般大于10的9次方的基因组需要构建一些小一些的基因文库。
3.对于限制性内切酶的选择有一定要求。（1）一般需要限制性内切酶需要把DNA切割为2-3Kb的片段，作为反向PCR扩增片段比较好，如果太短可能因为要扩增的DNA序列中相当部分是未知序列（因为也没有必要去测序，要是对于需要扩增的DNA全部序列都测定出来了，那就不用做反向PCR了），无法提供做够的PCR扩增的信息，连接时可能也会有麻烦出现；太长了反向PCR扩增反应体系可能无法有效完成。貌似长片段PCR体系尚未有效应用于反向PCR。（2）限制性内切酶在选择时要考虑DNA扩增片段的G+C 的含量。（3）酶切反应时尽量保证在限制性内切酶的最适反应条件下进行，以避免星号活性出现。商业用酶试剂经常还有相当数量的甘油，在酶切反应前一般应该用超滤去除掉甘油，然后再加入有关酶的缓冲溶液，这不就用不着使用分子筛更换缓冲溶液的操作了，除非实验者的确非常急于练习使用分子筛更换缓冲溶液的操作，而且正好有现成的已经转配好的层析柱。

（4）一般地，粘性末端的连接效率高于平头末端连接很多。
4.被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化。
T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。T4DNA连接酶在分子生物学中有广泛的应用。
被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化反应体系：
10X连接酶缓冲溶液： 10μL（购买T4 DNA Ligase商家会提供，使用时稀释10倍）,限制性内切酶DNA片段：5μL（溶解于TE缓冲溶液中，pH=8.0），
T4 DNA 连接酶：1μL，
无菌水： 84μL
限制性内切酶DNA片段终浓度一般不超过 3ng/μL，反应体系中的T4 DNA 连接酶用量可按产品说明书配制，一般对于上述反应体系而言，2.5U 的T4 DNA 连接酶足够了。被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化反应体系可在14摄氏度的水浴中过夜（大概13-18小时），然后升温至约65摄氏度使T4 DNA 连接酶失活已终止反应。很多书上对于自身环化反应的试验流程说的不清楚，所以我完整写出来，以供参考。当然也文献上说：被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化仅需要在16摄氏度水浴中1小时即可升温至约65摄氏度使T4 DNA 连接酶失活已终止反应。
（5）一般而言，被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化后，还是需要用新的针对于已知序列的那部分DNA片段进行再次限制性酶切，形成新的已知序列的那部分DNA片段在外侧的线状DNA，这样PCR就变成普通的PCR，效率会比直接对于环形DNA模板要高，因为至少环状DNA要考虑到DNA由于螺旋压紧而形成的复制阻力，PCR反应可是没有DNA拓扑异构酶来消除由于螺旋压紧而形成的复制阻力，也没有证据表明任何被限制性内切酶切开的DNA片段的自身环化后都会有足够的左手螺旋足以克服由于螺旋压紧而形成的复制阻力。
（6）第一轮PCR之后，用电泳检测，如果目标带不够窄和量，或有杂带出现，一般需要进行嵌套PCR再次扩增，需要至少一个不同于第一次PCR的引物的新引物。

今天凌晨刚刚写完的。仅供参考！

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2楼2014-07-17 02:56:29

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-17 02:56:29
反向PCR操作应该注意

1.分离的基因组DNA应该达到一定纯度，以利用后面的酶切、连接盒PCR扩增。还要足以用超滤方法除去乙醇，不然连接反应会有困难。DNA溶解于TE缓冲溶液中，pH=8.0。
2.基因组DNA的复杂程度不要 ...

很赞，但是我想做的是用反向PCR扩出来环状中间体，没有用到酶切什么的，最近在做克隆，目的片段和穿梭载体双酶切后连接却怎么都连接不上，没有结合子生长，还请前辈支招，不胜感激！

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3楼2014-07-17 09:32:47

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